人尿中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度的UPLC-MS/MS检测方法技术

本发明专利技术提供人尿中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度的UPLC‑MS/MS检测方法，包括以下步骤：(1)样品的制备:取待测尿液样品于试管或离心管中，加样1/10倍体积的水，涡旋混匀，加与水等量的浓盐酸和水3倍质量的氯化钠，涡旋混匀后，加入样品量5倍的乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min，15000rpm离心10min，取上清，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进行样分析;(2)特定条件下UPLC‑MS/MS检测样本，（3）根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算尿液中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸的浓度。本发明专利技术的有益效果是该方法简单快捷，灵敏度高，抗干扰能力强，适合检测多种食物或意外甲苯、二甲苯中毒的情况。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物分析领域，尤其是涉及一种人尿中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度的UPLC-MS/MS检测方法。
技术介绍
尿中马尿酸(HA)、甲基马尿酸(MHA)以及扁桃酸分别是接触甲苯、二甲苯在人体内的代谢产物，是接触甲苯、二甲苯的生物监测指标，在规定的采样时间内测定它们在尿液中含量的变化，可以反映工人的中毒程度。研究其分析方法，在临床和职业病防治方面都有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种操作简单、检测效率高、成本低的马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度检测方法，尤其适合对尿液中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度的检测。本专利技术的技术方案是：人尿中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度的UPLC-MS/MS检测方法，包括以下步骤：1)样品的制备取待测尿液样品于试管或离心管中，加样1/10倍体积的水，涡旋混匀，加与水等量的浓盐酸和水3倍质量的的氯化钠，涡旋混匀后，加入样品量5倍的乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min，15000rpm离心10min，取上清，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进样分析。2)UPLC-MS/MS分析：将处理后的样品用三重四级杆液质联用仪，在以下条件下进行分析液相条件：流动相：A:0.1％甲酸水溶液B:甲醇流速：0.3ml/min进样量：5μL柱温：45℃检测波长：254nm色谱柱：WatersACQUITYBEHC18,1.7μm,2.1*50mmColumn表1梯度洗脱程序Time/minA％B％095548020610906.19558955质谱条件：表2待测成分和内标的质谱检测参数其他质谱参数：毛细管电压(kV):3.2kV；源温度(℃):120；脱溶剂气温度(℃):350；脱溶剂气流量(L/Hr):800；气帘气流量(L/Hr):50；驻留时间(s)：0.1s3)根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算尿液中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸的浓度。为了取得更好的技术效果，样品的处理方法为：取100μL尿液，加10μL水，涡旋混匀后，加10μL浓盐酸，30mg氯化钠，涡旋混匀后，加500μL乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min后，15000rpm离心10min，取上清400μL，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进行样分析。以上甲基马尿酸包括2-甲基马尿酸和3-甲基马尿酸。以上方法中的步骤(3)标准曲线的制作过程如下：a.标准品处理：取100μL尿液，加10μL标准溶液，涡旋混匀后，加10μL浓盐酸，30mg氯化钠，涡旋混匀后，加500μL乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min后，15000rpm离心10min，取上清400μL，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进行分析，记录色谱图；马尿酸的定量系列浓度为：2，5，20，50，200，500，1000μg/ml，甲基马尿酸的定量系列浓度为：2，5，20，50，200，500，1000ng/ml，扁桃酸的定量系列浓度为：20，50，200，500，2000，5000，10000ng/ml。b.标准曲线的制备以待测物浓度为横坐标，待测物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W＝1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为定量标准曲线。为了取得更好的技术效果，人尿中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度的UPLC-MS/MS检测方法中还包括质控品的检测和基质效应的检测。质控样品的制备取100μL尿液，加10μL标准溶液，涡旋混匀后，加10μL浓盐酸，30μL氯化钠，涡旋混匀后，加500μL乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min后，15000rpm离心10min，取上清400μL，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进行样分析。马尿酸的质控样品浓度为：5，50，800μg/ml，甲基马尿酸的质控样品浓度为：5，50，800ng/ml，扁桃酸的质控样品浓度为：50，500，8000ng/ml。马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸的出峰时间及检测方式：具体见表3。表3待测化合物出峰时间及检测方式检测样品RT(min)检测方式扁桃酸2.60质谱MRM马尿酸2.92UV(254nm)2-甲基马尿酸3.86质谱MRM3-甲基马尿酸5.07质谱MRM在UPLC-MS分析时，按照常规方法绘制马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸，根据其标准曲线可以确定4种马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸线性方程、相关系数、检出限和定量限，具体见表4。表4UPLC-MS/MS测定马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸的线性方程，相关系数，检出限LOD和定量限LOQ本专利技术具有的优点和积极效果是：UPLC-MS/MS检测方法检测人尿中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度，简单快捷，灵敏度高，抗干扰能力强，适合检测多种食物或意外甲苯、二甲苯中毒的情况。附图说明图1是本专利技术的四种对羟基苯甲酸酯类的标准曲线图(A:扁桃酸；B:马尿酸；C:2-甲基马尿酸；D:3-甲基马尿酸)。图2是标线中的混合标准品色谱图(A:扁桃酸；B:马尿酸；C:2-甲基马尿酸；D:3-甲基马尿酸)具体实施方式实施例1分别取3份100μL的尿液，命名为样品1、样品2、样品3。(1)a.标准品处理：取100μL尿液，加10μL标准溶液，涡旋混匀后，加10μL浓盐酸，30mg氯化钠，涡旋混匀后，加500μL乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min后，15000rpm离心10min，取上清400μL，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进行分析，记录色谱图；马尿酸的定量系列浓度为：2，5，20，50，200，500，1000μg/ml，甲基马尿酸的定量系列浓度为：2，5，20，50，200，500，1000ng/ml，扁桃酸的定量系列浓度为：20，50，200，500，2000，5000，10000ng/ml。b.标准曲线的制备以待测物浓度为横坐标，待测物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W＝1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为定量标准曲线，见图1。图2是标线中的混合标准品的色谱图。(2)按以下相同的处理方法3份样品：加10μL水，涡旋混匀后，加10μL浓盐酸，30mg氯化钠，涡旋混匀后，加500μL乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min后，15000rpm离心10min，取上清400μL，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进行样分析。按照
技术实现思路
中的条件对2中样品的马尿酸、2-甲基马尿酸、3-甲基马尿酸和扁桃酸的上样检测，根据图1的标准曲线和表4中的线性范围计算各成分的含量，结果见表5。表5尿液样品中各成分含量测定实施例22.1回收率检测取100μL空白尿液，加10μL水，涡旋混匀后，加10μL浓盐酸，30mg氯化钠，涡旋混匀后，加500μL乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min后，15000rpm离心10min，取上清400μL，氮气吹干，再加入适量工作溶液，配制成低、中、高三个浓度的100μL的溶液(即同上述质控样品中各化合物对应的浓度)，平行配置6份，取5μL进样分析。用水配制低、中、高三个浓度的工作溶液(即同
技术实现思路
中质控样品中各化合物对应的浓度)，平行配置6份，取5μL进样分析。结果见表6。2.2基质效应检测取100μL空白尿液，加10μL标准溶液，涡旋混匀后本文档来自技高网...

【技术保护点】
人尿中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度的UPLC‑MS/MS检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)样品的制备取待测尿液样品于试管或离心管中，加样1/10倍体积的水，涡旋混匀，加与水等量的浓盐酸和水3倍质量的的氯化钠，涡旋混匀后，加入样品量5倍的乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min，15000rpm离心10min，取上清，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进样分析；2)UPLC‑MS/MS分析：将处理后的样品用三重四级杆液质联用仪，在以下条件下进行分析液相条件：流动相：A:0.1％甲酸水溶液         B:甲醇流速：0.3ml/min                   进样量：5μL柱温：45℃                        检测波长：254nm色谱柱：Waters ACQUITYBEH C18,1.7μm,2.1*50mm Column梯度洗脱程序Time/minA％B％095548020610906.19558955质谱条件：待测成分和内标的质谱检测参数其他质谱参数：毛细管电压(kV):3.2kV；            源温度(℃):120；脱溶剂气温度(℃):350；            脱溶剂气流量(L/Hr):800；气帘气流量(L/Hr):50；             驻留时间(s)：0.1s3)根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算尿液中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸的浓度。...

【技术特征摘要】
1.人尿中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)样品的制备取待测尿液样品于试管或离心管中，加样1/10倍体积的水，涡旋混匀，加与水等量的浓盐酸和水3倍质量的的氯化钠，涡旋混匀后，加入样品量5倍的乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min，15000rpm离心10min，取上清，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进样分析；2)UPLC-MS/MS分析：将处理后的样品用三重四级杆液质联用仪，在以下条件下进行分析液相条件：流动相：A:0.1％甲酸水溶液B:甲醇流速：0.3ml/min进样量：5μL柱温：45℃检测波长：254nm色谱柱：WatersACQUITYBEHC18,1.7μm,2.1*50mmColumn梯度洗脱程序Time/minA％B％095548020610906.19558955质谱条件：待测成分和内标的质谱检测参数其他质谱参数：毛细管电压(kV):3.2kV；源温度(℃):120；脱溶剂气温度(℃):350；脱溶剂气流量(L/Hr):800；气帘气流量(L/Hr):50；驻留时间(s)：0.1s3)根据样品的峰面积和标准曲线的回归方程中，计算尿液中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸的浓度。2.根据权利要求1所述的人尿中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于：步骤(1)样品的处理方法为：取100μL尿液，加10μL水，涡旋混匀后，加10μL浓盐酸，30mg氯化钠，涡旋混匀后，加500μL乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min后，15000rpm离心10min，取上清400μL，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进行样分析。3.根据权利要求1所述的人尿中马尿酸、甲基马尿酸及扁桃酸浓度的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于：步骤(3)标准曲线的制作过程如下：a.标准品处理：取100μL尿液，加10μL标准溶液，涡旋混匀后，加10μL浓盐酸，30mg氯化钠，涡旋混匀后，加500μL乙酸乙酯萃取，涡旋混匀1min后，15000rpm离心10min，取上清400μL，氮气吹干，再加100μL的水复溶，取上清5μL进行分析，记录色谱图；马尿酸的定量系列浓度为：2，5，20，50，200，500，1000μg/ml，甲基马尿酸的定量系列浓度为：2，5，20，50，200，500，1000ng/ml，扁桃酸的定量系列浓度为：20，50，200，500，2000，5000，10000ng/ml。b.标准曲线的制备以待...

【专利技术属性】
技术研发人员：张守庆，李英，李安平，王文佳，石小娜，张文怡，
申请(专利权)人：瀚盟测试科技天津有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12