一种瓦氏秋海棠的离体再生方法技术

本发明专利技术公开了一种瓦氏秋海棠的离体再生方法，对瓦氏秋海棠的种子进行萌发培养，诱导培养，生根培养，并对培养基进行了研究。本发明专利技术结合瓦氏秋海棠的生长特点，选用了合适的植物生长调节剂种类和浓度，能够有针对性地诱导瓦氏秋海棠叶片形成不定芽，继而诱导根的发育，最终使试管苗能够发育成为完整的植株，移栽成活率达到95％以上。利用本发明专利技术能快速、高效地繁殖瓦氏秋海棠，为今后更进一步合理利用该物种奠定良好的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物组织培养领域，具体涉及一种瓦氏秋海棠的离体再生方法。
技术介绍
瓦氏秋海棠(BegoniawallichianaLehm)为秋海棠科(Begoniaceae)秋海棠属(Begonia)多年生草本植物，原产于北美洲墨西哥等地。瓦氏秋海棠生长速度快，四季均可开花，雌雄同株异花，花白色；同时，其抗性较强，叶表面被生纤毛，不容易滋生病虫害，是一个潜在的成为模式植物的候选物种，也是一种良好的家庭观赏植物。但是，瓦氏秋海棠的种子细小，体积仅是拟南芥种子的一半大小，肉眼难辨，单株种植困难，并且，在温室或自然条件下，瓦氏秋海棠扦插不易成活，无法大量繁殖。目前，还没有见到瓦氏秋海棠组织培养的相关报道，因此，需要建立瓦氏秋海棠的离体培养和再生体系的方法，既可用于大量快繁，也为将来进行瓦氏秋海棠的分子育种及秋海棠属的分子生物学研究建立基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种瓦氏秋海棠的离体再生方法，有针对性地诱导瓦氏秋海棠叶片形成不定芽，继而诱导根的发育，最终使试管苗能够发育成为完整的植株，移栽成活率达到95％以上，繁殖周期约40～60天，增殖系数约为3～5左右，可以有效地扩繁和再生瓦氏秋海棠。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：一种瓦氏秋海棠的离体再生方法，包括如下步骤：1)萌发培养将瓦氏秋海棠种子消毒，然后播种于萌发培养基上，进行光照培养，培养温度为20～25℃，光照时间为12～18小时/天，种子生长10～15天后萌发，形成幼苗，待子叶抽出后，将幼苗分成单株，移苗至萌发培养基上，继续培养至长出叶片；2)诱导培养将步骤1)的幼叶剪切为面积在0.5～1cm2的叶片，作为外植体，接种于诱导培养基上进行光照培养20～30天，诱导产生愈伤组织和不定芽，培养温度为20～25℃，光照时间为12～18小时/天；其中，诱导培养基中含有：MS培养基，6-BA4.0～6.0mg/L，NAA0.1～0.4mg/L，2,4-D0.1～0.2mg/L和植物凝胶3～4g/L，pH调节到5.8～6.2；3)生根培养将步骤2)中获得的不定芽置于生根培养基中，进行生根培养，培养15～20天，获得瓦氏秋海棠的生根苗；4)移栽将步骤3)获得的生根苗移栽至栽培基质中，覆盖保鲜膜保湿，在温室中光照培养3～7天，揭膜，转入自然光下继续生长，及时浇水，施肥，经常规培养后获得瓦氏秋海棠栽培苗。进一步，步骤1)中所述的萌发培养基中包含：1/2MS培养基或MS培养基，蔗糖10～30g/L和植物凝胶3～4g/L，pH为5.8～6.2；步骤3)中生根培养基包含1/2MS，NAA0.1～0.3mg/L，植物凝胶3～4g/L。又进一步，步骤4)中所述的栽培基质为由蛭石：珍珠岩：土按体积比为1：1～2：1～2制成的混合基质。优选地，步骤1)中对瓦氏秋海棠种子进行消毒的过程为：将瓦氏秋海棠种子用酒精消毒8～10秒钟，去除酒精，加入次氯酸钠溶液消毒3～5分钟，弃去消毒液，再用无菌水洗3～5次。又优选地，步骤1)中，将瓦氏秋海棠的种子在消毒后用灭菌的0.1％低熔点琼脂糖悬浮。本专利技术提供另一种瓦氏秋海棠的离体再生方法，包括以下步骤：1)诱导培养将野外生长的瓦氏秋海棠叶片剪切为面积在0.5～1cm2的叶片，作为外植体，接种于诱导培养基上进行光照培养20～30天，诱导产生不定芽和愈伤组织，培养温度为20～25℃，光照时间为12～18小时/天；其中，诱导培养基中含有：MS培养基，6-BA4.0～6.0mg/L，NAA0.1～0.4mg/L，2,4-D0.1～0.2mg/L和植物凝胶3～4g/L，pH调节到5.8～6.2；2)生根培养将步骤1)中获得的不定芽插入到生根培养基中，进行生根培养，培养15～20天，获得瓦氏秋海棠的生根苗；3)移栽将步骤2)获得的生根苗移栽至栽培基质中，覆盖保鲜膜保湿，在温室中光照培养3～7天，揭膜，转入自然光下继续生长，及时浇水，施肥，经常规培养后获得瓦氏秋海棠栽培苗。进一步，步骤2)中的生根培养基包含1/2MS培养基，NAA0.1～0.3mg/L，植物凝胶3～4g/L。优选地，进行诱导培养时，在将所述的外植体接种至诱导培养基前，先对其进行消毒，利用0.1％HgCl溶液对叶片消毒4～8分钟。本专利技术所述的MS培养基为国际通用的培养基，其成分和配制方法参看谭文澄、戴策刚主编《观赏植物组织培养技术》，北京：中国林业出版社，1991，1/2MS培养基是指MS培养基中的无机盐成分含量减半。本专利技术所述各种培养基中添加的植物凝胶起支撑固定作用，其也可由琼脂等常用支撑固定材料代替。在离体培养条件下，培养基中植物生长调节剂对于细胞脱分化起关键性作用。本专利技术通过在培养基中添加植物生长调节剂，能够有目的地诱导瓦氏秋海棠不定芽的形成。由外植体直接诱导不定芽时，不定芽的诱导主要靠细胞分裂素6-BA(即6-苄基氨基嘌呤)和生长素NAA(即α-奈乙酸)的共同作用。现有技术中，诱导愈伤组织时，生长素类物质大多选用2，4-D(即2，4-二氯苯氧乙酸)或者NAA，或者2，4-D和NAA共同使用。但是，经过实验发现，在瓦氏秋海棠的愈伤组织的诱导过程中，由于基物种差异，选用上述方案时，在不使用细胞分裂素6-BA的情况下，会导致外植体直接死亡；添加细胞分裂素6-BA和生长素NAA时，并不能很好地诱导瓦氏秋海棠不定芽的产生，而在添加6-BA的情况下，当生长素NAA和2,4-D联合使用时，愈伤组织的形成和不定芽的产生则容易得多。本专利技术选择6-BA，NAA和2，4-D搭配使用，并合理配置其含量，可以很好地诱导不定芽和愈伤的产生，出芽率达到50～65％。经过生根，最终使试管苗能够发育成为完整的植株，移栽成活率达到95％以上，为今后更进一步利用该物种奠定良好的基础。本专利技术在将瓦氏秋海棠的种子在消毒后用灭菌的0.1％低熔点琼脂糖悬浮，再点播于萌发培养基上，可以使瓦氏秋海棠的种子均匀地分散在培养基中。瓦氏秋海棠种子细小，此方法可避免种子聚集在一起，从而提高种子萌发率和便于移栽。本专利技术的有益效果：本专利技术结合瓦氏秋海棠的生长特点，诱导过程中，在培养基中添加了合适含量的6-BA，NAA和2，4-D，能够有针对性地诱导瓦氏秋海棠的叶片形成不定芽，继而诱导生根，最终发育成为完整的植株，移栽成活率达到95％以上。附图说明图1为本专利技术实施例1中在萌发培养基上萌发的幼苗。图2为本专利技术实施例1中培养至长出幼叶的幼苗。图3为本专利技术实施例1中接种至诱导培养基上的外植体。图4为本专利技术实施例1中外植体在诱导培养基上形成的愈伤组织和不定芽。图5为本专利技术实施例1中不定芽转移到生根培养基中获得的生根苗。图6为本专利技术实施例1中的生根苗移栽后的瓦氏秋海棠栽培苗。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1一种瓦氏秋海棠的离体再生方法，包括如下步骤：1)萌发培养将瓦氏秋海棠种子消毒，然后用灭菌的0.1％低熔点琼脂糖悬浮，点播于萌发培养基上，进行光照培养，培养温度为20～25℃，光照时间为16小时/天，种子生长10～15天后萌发(参见图1)，萌发率几乎100％，形成幼苗，当小苗基部有少量根出现时，将幼苗分单株移苗，继续在萌发培养基上培养，长出幼叶，直至叶片展开(参见图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种瓦氏秋海棠的离体再生方法，包括如下步骤：1)萌发培养将瓦氏秋海棠种子消毒，然后播种于萌发培养基上，进行光照培养，培养温度为20～25℃，光照时间为12～18小时/天，种子生长10～15天后萌发，形成幼苗，待子叶抽出后，将幼苗分成单株，移苗至萌发培养基上，继续培养至长出叶片；2)诱导培养将步骤1)的幼叶剪切为面积在0.5～1cm2的叶片，作为外植体，接种于诱导培养基上进行光照培养20～30天，诱导产生愈伤组织和不定芽，培养温度为20～25℃，光照时间为12～18小时/天；其中，诱导培养基中含有：MS培养基，6‑BA 4.0～6.0mg/L，NAA0.1～0.4mg/L，2,4‑D 0.1～0.2mg/L和植物凝胶3～4g/L，pH调节到5.8～6.2；3)生根培养将步骤2)中获得的不定芽置于生根培养基中进行生根培养，培养15～20天，获得瓦氏秋海棠的生根苗；4)移栽将步骤3)获得的生根苗移栽至栽培基质中，覆盖保鲜膜保湿，在温室中光照培养3～7天后，揭膜，转入自然光下继续生长，及时浇水、施肥，经常规培养后获得瓦氏秋海棠栽培苗。

【技术特征摘要】
1.一种瓦氏秋海棠的离体再生方法，包括如下步骤：1)萌发培养将瓦氏秋海棠种子消毒，然后播种于萌发培养基上，进行光照培养，培养温度为20～25℃，光照时间为12～18小时/天，种子生长10～15天后萌发，形成幼苗，待子叶抽出后，将幼苗分成单株，移苗至萌发培养基上，继续培养至长出叶片；2)诱导培养将步骤1)的幼叶剪切为面积在0.5～1cm2的叶片，作为外植体，接种于诱导培养基上进行光照培养20～30天，诱导产生愈伤组织和不定芽，培养温度为20～25℃，光照时间为12～18小时/天；其中，诱导培养基中含有：MS培养基，6-BA4.0～6.0mg/L，NAA0.1～0.4mg/L，2,4-D0.1～0.2mg/L和植物凝胶3～4g/L，pH调节到5.8～6.2；3)生根培养将步骤2)中获得的不定芽置于生根培养基中进行生根培养，培养15～20天，获得瓦氏秋海棠的生根苗；4)移栽将步骤3)获得的生根苗移栽至栽培基质中，覆盖保鲜膜保湿，在温室中光照培养3～7天后，揭膜，转入自然光下继续生长，及时浇水、施肥，经常规培养后获得瓦氏秋海棠栽培苗。2.根据权利要求1所述的瓦氏秋海棠的组织培养方法，其特征在于，步骤1)中所述的萌发培养基中包含：1/2MS培养基或MS培养基，蔗糖10～30g/L以及植物凝胶3～4g/L，pH为5.8～6.2。3.根据权利要求1所述的瓦氏秋海棠的组织培养方法，其特征在于，步骤3)中生根培养基包含1/2MS培养基，NAA0.1～0.3mg/L，植物凝胶3～4g/L。4.根据权利要求1所述的瓦氏秋海棠的组织培养方法，其特征在于，步骤4)中所述的栽培基质为由蛭石：珍珠岩：土按体积比为1：1～2：1～2制成的...

【专利技术属性】
技术研发人员：田代科，张大生，陈青，赵喜双，付乃峰，刘青青，陈蒙娇，吴少华，
申请(专利权)人：上海辰山植物园，
类型：发明
国别省市：上海;31