一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法，包括以下步骤：配制类圆球茎诱导培养基和新类圆球茎培养成苗培养基，并进行灭菌处理；采用类圆球茎诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎的细胞薄层进行培养；采用新类圆球茎培养成苗培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的新类圆球茎培养成苗进行培养，制备得到剑叶虾脊兰和细花虾脊兰组培苗；将剑叶虾脊兰和细花虾脊兰组培苗移栽至基质中生长良好，植株成活率达90％以上。本发明专利技术可以大大缩短虾脊兰属植物的组培成苗时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体地说，涉及一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法。
技术介绍
植物薄层细胞培养(thincelllayerculture)技术是20世纪70年代发展起来的实验技术，最早是Tran以烟草的表皮细胞作为外植体培养材料并获得了根和芽的分化，并用它来研究器官发生的机理；一些研究把这一技术应用到植物组织1～2mm的薄层切片培养上，进而应用到一些植物的基因工程中。细花虾脊兰(Calanthemannii)，根状茎不明显，假鳞茎粗短，圆锥形，叶在花期尚未展开，折扇状，倒披针形或有时长圆形，花葶从假茎上端的叶间抽出，直立，高出叶层外，总状花序长4—10厘米，疏生或密生10余朵小花，花小，花期5月。剑叶虾脊兰是兰科虾脊兰属植物，具根状茎或假鳞茎。叶的大小、花色和唇瓣的形状、结构常有较大的变化，其中多数种类可供观赏，是切花或盆花的良好材料，具有一定的开发前景。虾脊兰用种子或分株法繁殖，其种子在自然条件下极难萌发，自然繁殖率低。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述的问题，提供了一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法，本方法采用组织培养方法，可以提供大量种苗，为此，利用细胞薄层培养虾脊兰属植物的技术将具有较高的价值和意义。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法，包括以下步骤：1)配制类圆球茎诱导培养基和新类圆球茎培养成苗培养基，并进行灭菌处理；2)采用外植体节段诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的外植体节段进行诱导，产生最初的类圆球茎；3)采用类圆球茎诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎的细胞薄层进行培养；4)采用新类圆球茎培养成苗培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的新类圆球茎培养成苗进行培养，制备得到剑叶虾脊兰和细花虾脊兰组培苗。进一步地，步骤1)中的类圆球茎诱导培养基具体为：添加2％(w/v)蔗糖和0.3％(w/v)Phytagel的VW培养基或添加2％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)Phytagel和0.1％(w/v)活性炭的VW培养基；以上培养基的pH值为5.8。进一步地，步骤1)中的新类圆球茎培养成苗培养基具体为：均以VW培养基为基础培养基，添加2％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)Phytagel和0.1％(w/v)活性炭；或者，添加2％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)Phytagel、1.0mg/L吲哚丁酸和0.1％(w/v)活性炭；或者，添加2％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)Phytagel、1.0mg/L6苄基腺嘌呤和0.1％(w/v)活性炭；或者，添加2％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)Phytagel、1.0mg/LIBA、1.0mg/L6-BA和0.1％(w/v)活性炭；以上培养基的pH值为5.8。进一步地，步骤1)中的灭菌处理具体为：将类圆球茎诱导培养基和新类圆球茎培养成苗培养基放入培养瓶中并及时放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为：121℃、105kPa下灭菌25分钟，灭好菌后及时取出倒入培养皿中，冷却备用。进一步地，步骤2)中的外植体节段诱导培养基具体为：添加0.06M蔗糖、2.27μMthidiazuron和0.3％(w/v)Phytagel的VW培养基，以上培养基的pH值为5.8。进一步地，步骤2)中的由外植体节段诱导产生最初类圆球茎的过程具体为：从剑叶虾脊兰和细叶虾脊兰离体植株上切取大约2毫米长的节段作为外植体，将节段在无菌条件下接入外植体节段诱导培养基；培养条件为25°C，14/10h光/暗交替的光照周期，光强为40μmolm-2s-1。进一步地，步骤3)中的采用类圆球茎诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎的细胞薄层进行培养具体为：在体视显微镜下，用无菌的镊子和手术刀徒手制备类圆球茎细胞薄层，将剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎做横切，得到厚度为0.6毫米的细胞薄层，将细胞薄层转入类圆球茎诱导培养基中培养。进一步地，步骤4)中的采用新类圆球茎培养成苗培养基对剑叶虾脊兰和细叶虾脊兰的新类圆球茎培养成苗进行培养的培养条件具体为：温度25℃，光照时间每天12小时，光照强度1500～2000lx，培养时间共4个月，培养期间要随时检查，发现污染的要及时去除。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)最适宜的细胞薄层切片诱导培养基经过2个月的培养后，Calanthedavidii(剑叶虾脊兰)和Calanthemannii(细花虾脊兰)的细胞薄层存活率分别为88.9％、63.3％；细胞薄层培养体系在两个月内的增值率分别为18.7％、14.5％；细胞薄层在培养基上产生新类圆球茎的平均数量最高达4.4个新一代PLB；PLB在培养基上的成苗率为100％。2)本专利技术可以大大缩短虾脊兰属植物的组培成苗时间。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术两种兰科植物类圆球茎细胞薄层产生新类圆球茎的情况，其中，a1-a3是指剑叶虾脊兰细胞薄层在添加活性炭的VW培养基上产生新类圆球茎的情况；b1-b3是指细花虾脊兰在添加活性炭的VW培养基上产生新类圆球茎。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。本专利技术提供一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法，包括以下步骤：1、培养基准备1)配制(1)类圆球茎诱导培养基的组成为添加2％(w/v)蔗糖和0.3％(w/v)Phytagel的VW培养基或添加2％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)Phytagel和0.1％(w/v)活性炭的VW培养基。(2)将剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的新类圆球茎培养成苗的培养基有四种，均以VW培养基为基础培养基：①2％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)Phytagel和0.1％(w/v)活性炭；②2％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)Phytagel、1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)和0.1％(w/v)活性炭；③2％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)Phytagel、1.0mg/L6苄基腺嘌呤(6-BA)和0.1％(w/v)活性炭；④2％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)Phytagel、1.0mg/LIBA、1.0mg/L6-BA和0.1％(w/v)活性炭。培养基pH值调节至5.8。2)灭菌将加入培养基的培养瓶及时放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为：121℃、105kPa下灭菌25分钟，灭好菌后及时取出倒入培养皿中，冷却备用；2.类圆球茎的诱导从剑叶虾脊兰和细花虾脊兰离体植株上切取大约2毫米长的节段(nodalsections)作为外植体，用于类圆球茎的诱导。将节段在无菌条件下接入添加了0.06M蔗糖2.27μMthidiazuron(TDZ)和3gL-1phytagel的VW培养基(外植体节段诱导培养基)。培养条件为25℃，14/10h(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)配制类圆球茎诱导培养基和新类圆球茎培养成苗培养基，并进行灭菌处理；2)采用外植体节段诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的外植体节段进行诱导，产生最初的类圆球茎；3)采用类圆球茎诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎的细胞薄层进行培养；4)采用新类圆球茎培养成苗培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的新类圆球茎培养成苗进行培养，制备得到剑叶虾脊兰和细花虾脊兰组培苗。

【技术特征摘要】
1.一种利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)配制类圆球茎诱导培养基和新类圆球茎培养成苗培养基，并进行灭菌处理；2)采用外植体节段诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的外植体节段进行诱导，产生最初的类圆球茎；3)采用类圆球茎诱导培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎的细胞薄层进行培养；4)采用新类圆球茎培养成苗培养基对剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的新类圆球茎培养成苗进行培养，制备得到剑叶虾脊兰和细花虾脊兰组培苗。2.根据权利要求1所述的利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法，其特征在于，所述步骤1)中的类圆球茎诱导培养基具体为：添加2％(w/v)蔗糖和0.3％(w/v)Phytagel的VW培养基或添加2％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)Phytagel和0.1％(w/v)活性炭的VW培养基；以上培养基的pH值为5.8。3.根据权利要求1所述的利用细胞薄层培养高效组培虾脊兰属植物的方法，其特征在于，所述步骤1)中的新类圆球茎培养成苗培养基具体为：均以VW培养基为基础培养基，添加2％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)Phytagel和0.1％(w/v)活性炭；或者，添加2％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)Phytagel、1.0mg/L吲哚丁酸和0.1％(w/v)活性炭；或者，添加2％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)Phytagel、1.0mg/L6苄基腺嘌呤和0.1％(w/v)活性炭；或者，添加2％(w/v)蔗糖、0.3％(w/v)Phytagel、1.0mg/LIBA、1.0mg/L6-BA和0.1％(w/v)活性炭；以上培养基的pH值为5.8。4.根据权利要求1所述的利用细胞薄层培养高效组培虾脊...

【专利技术属性】
技术研发人员：李唯奇，林亮，徐倩，贾艳霞，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53