本发明专利技术提供了一种制备青稞RPL11 cDNA基因的反转录PCR方法，同时本发明专利技术还提供了扩增该RPL11基因的PCR方法。进一步的，本发明专利技术提供了一种构建RPL11基因重组表达质粒的方法，并具体提供了该重组表达质粒的核苷酸序列。基于本发明专利技术提供的RPL11基因扩增和表达方法，可为下一步的品种培育和筛选提供有益选择。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因克隆与蛋白表达领域，具体公开了RPL11基因克隆表达的PCR方法和重组表达质粒的制备方法及表达方法。
技术介绍
核糖体蛋白L11(RibosomalproteinL11，RPL11)是核糖体大亚基上的一类重要蛋白，在蛋白合成过程中发挥着极为重要的作用。该蛋白有2个结构域：N末端结构域(NTD)与C末端结构域(CTD)。CTD体积大，结构简单，与23SrRNA中58个核苷酸长度的片段特异性结合，是核糖体内高度保守的结构域，NTD结构复杂，在蛋白合成的过程中具有分子开关的作用。研究显示，缺失RPL11的核糖体与肽链释放因子RF1的相互作用被严重消弱，RPL11突变菌株的蛋白合成效率降低4-6倍，由此可见该RPL11在蛋白合成中的重要作用。该蛋白在不同的物种中具有较高的同源性，但是目前的研究主要集中在原核生物方面，关于真核生物的RPL11报道很少，真核生物中RPL11的功能调节是否与原核中一样，目前还不清楚。本专利技术中涉及到重要的粮食作物青稞中RPL11的基因克隆与蛋白表达纯化，这将为后期蛋白的功能研究奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供一种青稞RPL11基因的克隆表达方法；提供一种制备青稞RPL11cDNA基因的反转录PCR方法；提供一种青稞RPL11基因DNA的PCR扩增方法；提供一种重组表达质粒pET28a-RPL11及其核苷酸序列和制备方法；提供一种青稞RPL11基因DNA的表达方法；提供一种通过重组表达质粒pET28a-RPL11表达RPL11基因DNA的方法。具体的，本专利技术提供了一种制备青稞RPL11cDNA基因的反转录PCR方法，包括以下步骤：(1)提取青稞320和/或喜8种子苗株新鲜叶片的总RNA；(2)使用反转录试剂盒进行反转录操作，采用20uL反应体系：在微量离心管中加入步骤(1)提取的总RNA5uL，加入4uL的5×RTReactionMix、1.4uL的Oligo(dT)、1uL的TUREscriptH-RTase/RIMix和8.6uL的8.6uL，轻轻混匀，离心；(3)42℃加热50分钟，65℃加热15分钟；(4)降解残余RNA；得到cDNA，-20℃保存。优选的，步骤(1)采用德国耶拿RNATUREscript1stStandcDNASYNTHESISKit提取试剂盒提取总RNA。同时，本专利技术提供了一种RPL11基因扩增的PCR方法，包括以下步骤：(1)按表2所述的PCR反应体系，在微量离心管中加入RPL11基因cDNA与引1和引物2，引物1的核苷酸序列如序列表SEQNOID.1的核苷酸序列所示，引物2的核苷酸序列如序列表SEQNOID.2的核苷酸序列所示；(2)95℃保持5分钟进行预变性后，将94℃变性1分钟、58℃退火1分钟和72℃延伸1分钟的步骤循环30次，于72℃延伸10分钟，得扩增的RPL11基因cDNA。表2PCR反应体系此外，本专利技术提供了一种重组表达质粒pET28a-RPL11，其核苷酸序列如序列表SEQNOID.5所示序列如下同时，本专利技术还提供了一种重组表达质粒pET28a-RPL11的制备方法，包括以下步骤：(1)取pET28a载体与权利要求4扩增得到的RPL11基因cDNA，分别用BamHI酶与XhoI酶进行双酶切，酶切条件如表3所示；表3pET28a载体与RPL11基因片段的酶切条件(2)取步骤(1)得到的pET28a载体酶切产物与RPL11基因cDNA酶切产物，进行1％琼脂糖电泳后使用胶回收试剂盒对目的片段进行切胶回收；(3)取0.2mL灭菌Eppendorf管一个，加入步骤(2)得到的pET28a(+)酶切回收片段0.5μl与RPL11酶切回收片段4.5μl，并加入5.0μl的T4DNA连接酶缓冲液，16℃连接过夜，得重组表达质粒pET28a-RPL11。进一步的，本专利技术提供了一种重组表达质粒pET28a-RPL11的表达方法，包括以下步骤：(1)将重组表达质粒pET28a-RPL11转化表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞；同时将提取的空载体pET28a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞，作阳性对照；BL21(DE3)感受态细胞不转化组作阴性对照；(2)以含硫酸卡那霉素(Kanamycinsulfate)100ug/mL的LB固体培养基培养步骤(1)所述的感受态细胞；挑取LB固体培养基上生长的已转化入pET28a-RPL11的BL21(DE3)菌落接种于5mL的含硫酸卡那霉素100ug/mLLB液体培养基；(3)37℃振荡培养至OD600约为0.5时，取1mL按1∶100比例接种于含硫酸卡那霉素的LB液体培养基中；(4)将培养的100mL培养液分为2份，其中一份加硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，另一份不加硫代半乳糖苷作为对照；加入硫代半乳糖苷至终浓度为0.1mmol/L，调整培养温度至25℃转速为220转每分钟，继续振荡培养16h。(5)取硫代半乳糖苷诱导后菌液1mL，离心，弃上清，沉淀用生理盐水洗涤后，加入100ul生理盐水及5×SDS上样缓冲液25ul，100℃煮沸10min，离心，取上清进行SDS-PAGE；对未诱导菌液做同样处理，观察表达情况；同时将LB液体培养未转化及空载体pET28a(+)转化的BL21作为对照；优选的步骤(4)所述表达条件为：0.1mM硫代半乳糖苷，25℃，转速为220转每分钟。本专利技术首次公开了从青稞植物中提取RNA克隆RPL11基因的方法。根据本专利技术提供的方法可有效的获得和表达RPL11基因，为下一步的品种培育和筛选提供了有益选择。同时本专利技术还提供了一种重组表达质粒pET28a-RPL11及其制备方法，通过该重组表达质粒可有效表达RPL11基因序列，为基于RPL11基因序列的品种开发和利用奠定了有利条件。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想的前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或者变更。以下通过实施例形式的具体实施方法，对本专利技术的上述内容在做进一步的详细说明，但不应理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1酶切验证实验图谱M：DNA分子量marker1：pET28-RPL11的BamHI与XhoI双酶切产物图2a、图2bpET28a-RPL11测序结果与已知目的基因的序列比对07RPL1110025429为基因组RPL11目的序列07-2T7为重组表达质粒Pet28a-RPL11测序结果图3pET28a-RPL11在BL21中蛋白表达的SDS-PAGE电泳图谱M：标准蛋白分子量1：含载体Pet28a-RPL11菌未诱导2：含载体Pet28a-RPL11菌诱导3：含载体Pet28a-RPL11菌诱导上清4：载体Pet28a-RPL11菌诱导沉淀以下为具体实施方式实施例一、总RNA抽提和反转录，以及RPL11基因的PCR扩增1.RNA抽提及反转录1.1用青稞320及喜8种子发芽成长成苗1.2采取新鲜叶片用植物提取试剂盒抽提RNA并检测，1.3提取步骤如下：1.3.1仪器与试剂主要仪器：SCILOGEXD3024R离心机、analyt本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种青稞RPL11 cDNA基因的反转录PCR方法，包括以下步骤：(1)提取青稞320和/或喜8种子苗株新鲜叶片的总RNA；(2)使用反转录试剂盒进行反转录操作，采用20uL反应体系：在微量离心管中加入步骤(1)提取的总RNA5uL，加入4uL的5×RT Reaction Mix、1.4uL的Oligo(dT)、1uL的TUREscript H‑RTase/RI Mix和8.6uL的8.6uL，轻轻混匀，离心；(3)42℃加热50分钟，65℃加热15分钟；(4)降解残余RNA；得到cDNA，‑20℃保存。
【技术特征摘要】
1.一种青稞RPL11cDNA基因的反转录PCR方法，包括以下步骤：(1)提取青稞320和/或喜8种子苗株新鲜叶片的总RNA；(2)使用反转录试剂盒进行反转录操作，采用20uL反应体系：在微量离心管中加入步骤(1)提取的总RNA5uL，加入4uL的5×RTReactionMix、1.4uL的Oligo(dT)、1uL的TUREscriptH-RTase/RIMix和8.6uL的8.6uL，轻轻混匀，离心；(3)42℃加热50分钟，65℃加热15分钟；(4)降解残余RNA；得到cDNA，-20℃保存。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)采用TUREscript1stStandcDNASYNTHESISKit反转录试剂盒提取总RNA。3.一种RPL11基因的PCR方法，包括以下步骤：(1)按表2所示的PCR反应体系，在微量离心管中加入RPL11基因cDNA与引1和引物2，引物1的核苷酸序列如序列表SEQNOID.1的核苷酸序列所示，引物2的核苷酸序列如序列表SEQNOID.2的核苷酸序列所示；表2PCR反应体系(2)95℃保持5分钟进行预变性后，将94℃变性1分钟、58℃退火1分钟和72℃延伸1分钟的步骤循环30次，于72℃延伸10分钟，得扩增的RPL11基因cDNA。4.一种重组表达质粒pET28a-RPL11，其核苷酸序列如序列表SEQNOID.5的核苷酸序列所示。5.一种重组表达质粒pET28a-RPL11的制备方法，包括以下步骤：(1)取pET28a载体与权利要求3扩增得到的RPL11基因cDNA，分别用BamHI酶与Xhol酶进行双酶切，酶切条件如表3所示；表3pET28a载体与RPL11基因片段的酶切条件(2)取步骤(1)得到的pET28a载体酶切产物与RPL11基因cDNA酶切产物，进行1％琼脂糖电泳后使...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾兴权，原红军，徐齐君，韦泽秀，王玉林，扎桑，白丽军，尼玛扎西，
申请(专利权)人：西藏自治区农牧科学院，成都生命基线科技有限公司，
类型：发明
国别省市：西藏;54
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