一种多酶复合抑菌剂制造技术

本发明专利技术涉及一种多酶复合抑菌剂，主要解决体外诊断试剂盒中常用抑菌剂不能有效抑制霉菌、酵母菌及放线菌的问题。本发明专利技术的复合抑菌剂主要成分及配比为：几丁质内切酶0.1％‑20％、β‑1,3葡聚糖酶0.1％‑30％、纤维素酶0.01％‑10％、磷酸甘露糖酶0.1％‑30％、EDTA(或EGTA)10‑90％。其可以为固态组合物加入含菌试剂，也可以溶液状态加入含菌试剂。本发明专利技术的多酶复合抑菌剂对各种微生物均有抑制作用，真核微生物对其尤为敏感。相对于抗生素而言，环境友好，本发明专利技术抑菌剂可降解，无残留，无产生抗药菌的风险；对于叠氮钠等化学防腐剂而言具有无毒、无害等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种多酶复合抑菌剂，属于多酶复合物抑制微生物生长领域。
技术介绍
体外诊断试剂盒中由于存在各种蛋白、营养物质，所以很容易长菌，造成试剂失效，所以各种试剂均添加抑菌剂。目前试剂盒中常用的抑菌剂有以下几类：1)叠氮钠、MVP、、物质，这类物质通常有毒甚至剧毒，抑制的目标主要为细菌、放线菌。对酵母菌、霉菌抑菌作用不明显。2)柠檬酸钠、山梨酸钾等防腐剂，在酸性条件下可以明显抑制酵母与霉菌的生长，但是在中性或碱性环境中抑制作用较低。3)各种抗生素，虽然绝大部分微生物都有与之相应的抗生素，但是由于抗生素容易产生耐药菌，因此不建议使用。除以上几类抑菌剂外最近有人有使用溶菌酶作为抑菌剂，这种抑菌剂只对革兰氏阳性菌有较大的抑菌作用，对革兰氏阴性菌抑制效果不佳，对真核微生物没有明显抑菌效果。本专利技术的复合酶抑菌剂主要能够抑制各种微生物生长。对真核微生物尤其是酵母菌抑制效果更佳。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述试剂盒中常用抑菌剂的不足，使用不同种类的酶对不同种类微生物对细胞壁进行分解而抑制其生长。本专利技术所依据的原理：酵母菌的细胞壁主要成分是葡聚糖、甘露聚糖以及少量脂类与蛋白质，β-1,3葡聚糖酶能够分解葡聚糖，磷酸甘露糖酶可以分解其中的甘露聚糖，最终使细胞壁溶解，使细胞容易破裂。霉菌细胞壁的主要成分为几丁质与纤维素，本专利技术中几丁质内切酶和纤维素酶能够分别分解霉菌(及部分酵母菌)细胞壁中的几丁质和纤维素使细胞容易破裂。Mg2+，Ca2+以及其他一些微量元素是微生物部分酶的必要辅基，也是细胞表面的组成部分，螯合剂EDTA或EGTA加入后可以络合这些离子使微生物难以生长并且使细胞壁结构松散更加容易破裂。为实现上述目的，本专利技术的多酶复合抑菌剂主要成分为：几丁质内切酶；β-1,3葡聚糖酶；纤维素酶；磷酸甘露糖酶。其中，基于抑菌剂总重量，几丁质内切酶0.1％－20％；β-1,3葡聚糖酶0.1％－30％；纤维素酶0.01％－10％；磷酸甘露糖酶0.1％－30％；多酶复合抑菌剂中还添加EDTA、EGTA，10％－90％。其可以为固态组合物加入含菌试剂，固态时加入比例为0.1-5g/L试剂。也可以溶液状态加入含菌试剂。附图说明图1为本专利技术不同配方对各种微生物抑制率图图2为本专利技术不同配方对各种微生物抑制率对数图具体实施方式实施例1：多酶复合抑菌剂配方1对毕赤酵母GS115、大肠杆菌BL21、金黄色葡萄球菌、马尼菲青霉菌、灰色链霉菌的抑制作用配方1：分别称取几丁质内切酶2mg(3.39％)，β-1,3葡聚糖酶3mg(5.08％)，纤维素酶1mg(1.69％)，磷酸甘露糖酶3mg(5.08％)，EDTA50mg(84.75％)，总重量59mg。加入100mMpH7.4磷酸钾缓冲液溶解至10ml，终浓度为几丁质内切酶200mg/L，β-1,3葡聚糖酶300mg/L，纤维素酶100mg/L，磷酸甘露糖酶300mg/L，EDTA5000mg/L。此配方为配方1。(1)多酶复合抑菌剂配方1对毕赤酵母GS115的抑制作用将多酶复合抑菌剂(配方1)1ml，加入到1ml菌浓度为105CFU/ml毕赤酵母GS115菌液和8mlYPD培养基中(抑菌剂总量为0.59g/L)，30度作用16h，之后在YPD培养基平板上涂布，计算菌浓度C1。对照组为1ml水加入到1ml菌浓度为105CFU/ml毕赤酵母GS115菌液和8mlYPD培养基中，30度作用16h，之后在YPD培养基平板上涂布，计算菌浓度C0。抑菌率＝C0/C1。本实验最终抑菌率为303。(2)多酶复合抑菌剂配方1对大肠杆菌BL21的抑制作用将多酶复合抑菌剂(配方1)1ml，加入到1ml菌浓度为106CFU/ml大肠杆菌BL21菌液和8mlLB培养基中，37度作用5h，之后在LB固体培养基平板上涂布，计算菌浓度C1。对照组为1ml水加入到1ml菌浓度为106CFU/ml大肠杆菌BL21菌液和8mlLB培养基中，37度作用5h，之后在LB固体培养基平板上涂布，计算菌浓度C0。抑菌率＝C0/C1。本实验最终抑菌率为117。(3)多酶复合抑菌剂配方1对金黄色葡萄球菌的抑制作用将多酶复合抑菌剂(配方1)1ml，加入到1ml菌浓度为106CFU/ml金黄色葡萄球菌菌液和8ml营养肉汤培养基中(牛肉膏3g水1000mL蛋白胨5gPH7.2～7.4)，37度作用5h，之后在营养肉汤固体培养基平板上涂布，计算菌浓度C1。对照组为1ml水加入到1ml菌浓度为106CFU/ml金黄色葡萄球菌菌液和8ml营养肉汤培养基中，37度作用5h，之后在营养肉汤固体培养基平板上涂布，计算菌浓度C0。抑菌率＝C0/C1。本实验最终抑菌率为128。(4)多酶复合抑菌剂配方1对马尼菲青霉菌的抑制作用将多酶复合抑菌剂(配方1)1ml，加入到1mlOD600＝0.1的马尼菲青霉菌培养液和8ml察氏培养基(硝酸钠3g/L磷酸氢二钾1g/L硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g/L氯化钾0.5g/L硫酸亚铁0.01g/L蔗糖30g/L)，25度震荡48h，之后在测定600nm下吸光度(光径1cm)：OD1。测定方法为发酵液4000rpm离心5min，适用PBS重悬至1ml，测定重悬液600nm下的吸光度，除以10即为发酵液吸光度。对照组为1ml水加入到1mlOD600＝0.1的马尼菲青霉菌培养液和8ml察氏培养基中，25度震荡48h，之后在测定600nm下吸光度(光径1cm)：OD0。抑菌率＝OD0/OD1。OD测定方法同上。本实验最终抑菌率为267。(5)多酶复合抑菌剂配方1对灰色链霉菌的抑制作用将多酶复合抑菌剂(配方1)1ml，加入到1mlOD600＝0.1的灰色链霉菌培养液和8mlLA1液体培养基(酵母膏6.0％，葡萄糖4.0％，K2SO41.0％，MgSO41.0％，pH7.8，121℃灭菌30min)，30震荡培养24h，之后在测定OD600：OD1。OD测定方法同(4)。对照组为1ml水加入到1mlOD600＝0.1的灰色链霉菌培养液和8mlLA1液体培养基中，30度震荡24h，之后在测定OD600：OD0。抑菌率＝OD0/OD1。OD测定方法同(4)。本实验最终抑制率为113。实施例2：多酶复合抑菌剂配方2对毕赤酵母GS115、大肠杆菌BL21、金黄色葡萄球菌、马尼菲青霉菌、灰色链霉菌的抑制作用配方2：分别称取几丁质内切酶10mg(17.18％)，β-1,3葡聚糖酶8mg(13.74％)，纤维素酶0.02mg(0.03％)，磷酸甘露糖酶0.2mg(0.34％)，EDTA40mg(68.70％)，总重量58.22mg。加入100mMpH7.4磷酸钾缓冲液溶解至10ml，终浓度为几丁质内切酶1000mg/L，β-1,3葡聚糖酶800mg/L，纤维素酶2mg/L，磷酸甘露糖酶20mg/L，EDTA4000mg/L。此配方为配方2。(1)多酶复合抑菌剂配方2对毕赤酵母GS115的抑制作用方法同实施例1，本实验最终抑菌率为2314。(2)多酶复合抑菌剂配方2对大肠杆菌BL21的抑制作用方法同实施例1，本实验最终抑菌率为108。(3)多酶复合抑菌剂配方2对金黄色本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多酶复合抑菌剂，其特征在于，包括如下组分：几丁质内切酶；β‑1,3葡聚糖酶；纤维素酶；磷酸甘露糖酶。

【技术特征摘要】
1.一种多酶复合抑菌剂，其特征在于，包括如下组分：几丁质内切酶；β-1,3葡聚糖酶；纤维素酶；磷酸甘露糖酶。2.如权利要求1所述的多酶复合抑菌剂，其特征在于：几丁质内切酶基于抑菌剂总重量的0.1％－20％。3.如权利要求1所述的多酶复合抑菌剂，其特征在于：β-1,3葡聚糖酶基于抑菌剂总重量的0.1％－30％。4.如权利要求1所述的多酶复合抑菌剂，其特征在于：纤维素酶基于抑菌剂总重量的0.01％－10％。5.如权利要求1所述的多酶复合抑菌剂，其特征在于：磷酸甘露糖酶基于抑菌剂总重量...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐占勇，郑长龙，
申请(专利权)人：北京达成生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11