一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和培养方法技术

本发明专利技术公开了一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和培养方法，该培养液包括TCM-199基础培养基和添加的猪卵泡液、胎牛血清、eCG、hCG、EGF和IGF-1。本发明专利技术的猪卵母细胞体外成熟培养液能够显著地提高猪卵母细胞体外培养的成熟率。实验证实，本发明专利技术的培养液在卵母细胞采集之后，经42-44h成熟培养后极体率可稳定在80%，孤雌胚胎发育率可达85%，整个成熟培养过程中无需更换培养液，操作简单。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法，以及使用该培养液培养猪卵母细胞的方法。
技术介绍
卵母细胞体外培养成熟是胚胎生物技术的基础和关键环节。目前，胚胎技术已极大地推畜牧业和医学的进程，如品种改良、转基因抗病品种培育、人类疾病模型的制备、动物生物反应器药用蛋白的生产及发育机理的探究等。猪的体细胞克隆及疾病模型制备等都需要大量具有发育潜能的卵母细胞，但目前的猪卵母细胞体外成熟率不够理想。目前，猪的卵母细胞培养有以下几种体外培养基础液，如北卡罗来纳州立大学研制的培养液(NorthCarolinaStateUniversity(NCSU23/NCSU37)、PZM系列(PZM-3/PZM-4/PZM-5)培养液和TCM-199。其中TCM-199是公认的最成功的培养基础液，基本能满足猪卵母细胞体外发育代谢和营养需要。然而这些经体外培养猪卵母细胞表明，其成熟率很低，我们还需要对体外培养液进行改进，以提高猪卵母细胞体外培养的成熟率。
技术实现思路
专利技术人经研究，在TCM-199基础液基础上，通过添加激素和营养物质，显著提高猪卵母细胞体外培养的成熟率。与现有报道的猪卵母细胞体外成熟培养液相比，本专利技术的培养液在卵母细胞采集之后，经42-44h成熟培养后极体率可稳定在80％，整个成熟培养过程中无需更换培养液，操作简单。基于此，本专利技术提供一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法，以及使用该培养液培养猪卵母细胞的方法。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种猪卵母细胞体外成熟培养液，包括TCM-199基础培养基和添加的猪卵泡液、胎牛血清、eCG、hCG、EGF和IGF-1。在本专利技术的一个优选实施方案中，按体积百分含量计，含有10％的猪卵泡液和10％的胎牛血清，并含有10-15IU/mL的eCG、10-15IU/ml的hCG、低于100ng/mL的EGF和低于40ng/mL的IGF-1。在本专利技术的一个优选实施方案中，还包括谷氨酰胺和庆大霉素。在本专利技术的一个优选实施方案中，包括如下组分：根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供一种制备第一方面所述的猪卵母细胞体外成熟培养液的方法，该方法将猪卵泡液、胎牛血清、eCG、hCG、EGF和IGF-1添加到TCM-199基础培养基中，任选地，加入谷氨酰胺和庆大霉素，制得上述培养液。在本专利技术的一个优选实施方案中，上述培养液包括如下组分：根据本专利技术的第三方面，本专利技术提供一种猪卵母细胞体外成熟培养方法，该方法包括将猪卵母细胞置于第一方面所述的培养液中培养。在本专利技术的一个优选实施方案中，上述培养液置于5％CO2饱和湿度的培养箱至少平衡6小时再用于培养所述猪卵母细胞。在本专利技术的一个优选实施方案中，上述猪卵母细胞从4-7mm的卵泡挑取。在本专利技术的一个优选实施方案中，上述猪卵母细胞在38.5℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养42-44小时。本专利技术的猪卵母细胞体外成熟培养液能够显著地提高猪卵母细胞体外培养的成熟率。实验证实，本专利技术的培养液在卵母细胞采集之后，经42-44h成熟培养后极体率可稳定在80％，孤雌胚胎发育率可达85％，整个成熟培养过程中无需更换培养液，操作简单。附图说明图1为本专利技术一个实施例中使用TCM-199基础液添加eCG和hCG激素以及EGF和IGF-1对猪卵母细胞体外成熟效果。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。提高猪卵母细胞体外培养的成熟率，对于获取大量具有发育潜能的卵母细胞具有重要意义，从而为猪的体细胞克隆及疾病模型制备准备材料。然而，目前的猪卵母细胞体外培养使用的培养液还不能使猪卵母细胞体外培养的成熟率达到理想的水平。本专利技术人在目前常用的TCM-199基础培养基的基础上，通过添加猪卵泡液(PFF)、胎牛血清(FBS)、eCG、hCG、EGF和IGF-1，制得了一种能够显著地提高猪卵母细胞体外培养的成熟率的培养液。本专利技术一个实施方案的培养液，包括TCM-199基础培养基和添加的猪卵泡液、胎牛血清、eCG、hCG、EGF和IGF-1。其中，TCM-199基础培养基是一种经典的细胞体外培养系统，用其作为母液安全、可靠。TCM-199基础培养基可以从商业渠道购得，如Gibco公司或Sigma公司。猪卵泡液(PFF)，可以获取自体外卵母细胞收集时离心所得。其作用是提供卵母细胞发育所需的必须因子。胎牛血清(FBS)是多种体外培养液中的成分之一，已经证明其作为体外培养用的培养液成分之一的有效性和安全性。eCG，又称孕马血清促性腺激素，即PMSG(PregnantMareSerumGonadotropin)，也称为马绒毛膜促性腺激素。它是在怀孕母马血清中发现的一种激素。并已知在妊娠马属动物(驴、斑马等)都有产生，所以目前通常称为马属动物绒毛膜促性腺激素(eCG)。hCG，即人绒毛膜促性腺激素，是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，它是由α和β二聚体的糖蛋白组成。EGF，即表皮生长因子，是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，是类EGF大家族的一个成员，是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。IGF-1，即胰岛素样生长因子1，也被称为生长调节素CsomatomedinC，是一个由人类基因IGF1编码的蛋白质。本专利技术中，PFF、FBS、eCG、hCG、EGF和IGF-1在TCM-199基础培养基中协同作用，共同提高猪卵母细胞体外培养的成熟率。本专利技术的一个优选实施方案中，按体积百分含量计，含有10％的猪卵泡液和10％的胎牛血清，并含有10-15IU/mL的eCG、10-15IU/ml的hCG、50ng/mL的EGF和10ng/mL的IGF-1。IU表示国际单位。专利技术人已经证实，EGF的含量在100ng/mL以下均能取得预期效果，并且在此范围内其效果随着EGF含量的增加有增加的趋势，然而EGF含量超出100ng/mL并没有显示效果进一步提高，因此从经济和实用的角度考虑，选择EGF的含量在100ng/mL以下；IGF-1的含量在40ng/mL以下均能取得预期效果，并且在此范围内其效果随着IGF-1含量的增加有增加的趋势，然而IGF-1含量超出40ng/mL并没有显示效果进一步提高，因此从经济和实用的角度考虑，选择IGF-1的含量在40ng/mL以下。本专利技术一个优选的实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，包括TCM‑199基础培养基和添加的猪卵泡液、胎牛血清、eCG、hCG、EGF和IGF‑1。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，包括TCM-199基础培养基和添加的猪卵泡液、胎牛血清、eCG、hCG、EGF和IGF-1。
2.根据权利要求1所述的猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，按体积百分含量计，含有10%的猪卵泡液和10%的胎牛血清，并含有10-15IU/mL的eCG、10-15IU/ml的hCG、低于100ng/mL的EGF和低于40ng/mL的IGF-1。
3.根据权利要求1或2所述的猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，还包括谷氨酰胺和庆大霉素。
4.根据权利要求3所述的猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，包括如下组分：
谷氨酰胺0.05-0.20mg/mL；
庆大霉素0.02-0.10mg/mL；
猪卵泡液10%（v/v）；
胎牛血清10%（v/v）；
eCG10-15IU/mL；
hCG10-15IU/ml；
EGF50ng/mL；
IGF-110ng/mL；
TCM-199余量。
5.一种制备权利要求1-4任一项所述的猪卵母细胞体外成熟培养液的方法，其特征在于，所述方法将猪卵泡液、胎牛血清、eCG、hCG、EGF和IGF-...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡志明，牟丽莎，冯万有，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44