本发明专利技术公开了一种基于多腺嘌呤的DNA捕获探针、生物传感器及其检测方法。所述DNA捕获探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示。本发明专利技术利用腺嘌呤与金电极的相互作用，将包含多个连续腺嘌呤的DNA探针固定在金电极表面，首次构建了基于多腺嘌呤DNA的电化学生物传感器，可以达到基于巯基修饰DNA组装金电极同样的效果，将开创此类新型电化学生物传感器的新纪元。本发明专利技术能够高灵敏度、高特异性地检测DNA，灵敏度可高至1pM，操作简便，应用前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于电化学检测领域，具体地涉及一种基于多腺嘌呤的DNA捕获探针、生物传感器及其检测方法。
技术介绍
电化学的发展历史悠久，与尖端科学技术和学科的发展紧密相关，电化学生物传感器具有特异性分子识别功能，在疾病基因诊断、抗癌药物筛选等方面显示了广阔的应用前景，是当今生物学、医学领域的前沿的研究手段。电化学生物传感器测定DNA的大致步骤包括：一、DNA捕获探针的固定，即将某一特定序列的单链DNA(ssDNA)固定在电极的表面；二、杂交，将固定有DNA捕获探针的电极放入到含有与之匹配的待测DNA的被测溶液中，使待测DNA与DNA捕获探针在电极表面发生杂交反应形成双链DNA(dsDNA)；三、将杂交反应的信号转化为可测定的电化学信号；四、将电化学信号进行放大检测。DNA捕获探针的固定是DNA电化学传感器制作中的首要问题，固定的量和活性直接影响传感器的灵敏度。目前常见的DNA固定方法主要有共价键合法、自组装法和亲和素-生物素方法。共价键和法是通过形成共价键，如酰胺键、酯键、醚键等使DNA固定到电极表面，需要对电极表面进行活化预处理，引入所需的活性基团，通过双官能团试剂或偶联活化剂将衍生后的DNA分子与电极联结。但是该方法由于形成共价键的化学反应效率不大的问题，导致组装在电极表面的DNA捕获探针的密度不高。自组装法(SAM法)主要用于DNA捕获探针在金电极表面的固定，具体方法是将DNA捕获探针的末端巯基化，通过金硫键形成自组装层达到固定DNA的目的。但是该方法需要巯基修饰，成本较高，并且在实验操作中容易形成双硫键而影响检测结果的准确性。亲和素-生物素法是将亲和素(avidin)通过静电作用或共价偶联作用连接于电极表面，利用生物素和亲和素之间极强的生物识别亲和作用，将生物素修饰的DNA固定到电极上。以上三种方法均需要对DNA捕获探针进行修饰，合成成本较高，步骤繁琐。然而，目前本领域技术人员难以明确如何调控电化学生物传感器电极表面DNA捕获探针的组装密度，这直接制约了电化学生物传感器的进一步发展，因此亟待获得一种全新的DNA捕获探针固定方法及效果优异的电化学生物传感器。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是解决了调控电化学生物传感器电极表面DNA捕获探针的组装密度的难题，从而提供了一种基于多腺嘌呤的DNA捕获探针、生物传感器及其检测方法。该DNA捕获探针和生物传感器能够灵敏度高、特异性佳地检测待测DNA，操作简便，应用前景广阔。本专利技术的专利技术人经过深入的研究和反复的试验，利用腺嘌呤与金电极的相互作用，设计了包含多个连续腺嘌呤(polyA)的DNA捕获探针，并且将这样的DNA捕获探针固定在金电极表面，通过“夹心式”的杂交方法，将待测DNA和信号探针引入金电极表面，再依据检测杂交前后催化氧化还原电流变化指示待测DNA的浓度，从而完成了本专利技术。本专利技术的技术方案之一是：一种基于多腺嘌呤的DNA捕获探针，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示。本专利技术中，所述的多腺嘌呤的DNA捕获探针含有不同个数(5个、10个、20个、30个和40个)的腺嘌呤，分别称为polyA5、polyA10、polyA20、polyA30和polyA40。本专利技术中，较佳地，所述DNA捕获探针为polyA30，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.4所示。本专利技术的技术方案之二是：一种电化学生物传感器，其由包括以下步骤的方法制备而成：(1)制备基于多腺嘌呤的DNA捕获探针，所述DNA捕获探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示；(2)将步骤(1)所得的基于多腺嘌呤的DNA捕获探针滴加到电极上，反应，得组装电极；(3)用巯基己醇(MCH)对步骤(2)所得的组装电极的空位封闭，得封闭的电极。本专利技术中，步骤(2)为：将步骤(1)所得的基于多腺嘌呤的DNA捕获探针滴加到电极上，反应，得组装电极。其中，所述DNA捕获探针滴加到电极上时的组装密度较佳地为0.01～3μM，更佳地为0.1μM。所述反应的温度为20～40℃，较佳地为25℃。所述组装的时间为本领域常规的时间，较佳地为过夜，即大于12小时。步骤(2)中，所述的电极为常规，较佳地，所述的电极为处理干净的电极；更佳地，所述处理干净的电极由包括以下步骤的方法制得：经物理打磨、硫酸电化学清洗，再用超纯水彻底冲洗电极表面，然后用N2吹干。所述的电极较佳的是金电极。本专利技术中，步骤(3)为：用巯基己醇(MCH)对步骤(2)所得的组装电极的空位封闭，得封闭的电极。其中，所述MCH的浓度较佳地为0.01～1mM，更佳地为0.1mM。所述封闭的时间为5～60分钟，较佳地为30分钟。所述封闭的温度为本领域常规的温度，较佳地为25℃。本专利技术中，经研究发现证实，最佳地，上述电化学生物传感器采用所述的polyA30作为DNA捕获探针；polyA30的组装密度为0.1μM；且步骤(3)中采用0.1mMMCH封闭30分钟。本专利技术的技术方案之三是：一种利用上述的电化学生物传感器检测待测DNA的方法，其包括以下的步骤：(Ⅰ)将待测DNA和核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.7所示且在3’端连接生物素的信号探针预杂交，得预杂交物A；(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)所得的预杂交物A与如权利要求2～5任一项所述的电化学生物传感器的电极上的DNA捕获探针杂交，得杂交的电极；(Ⅲ)向步骤(Ⅱ)所得的杂交的电极上滴加亲和素-辣根过氧化酶后孵化；加入底物TMB，进行检测分析。本专利技术中，步骤(Ⅰ)为：将待测DNA和核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.7所示且在3’端连接生物素的信号探针预杂交，得预杂交物A。其中，较佳地，所述待测DNA的浓度为0～1000pM，所述信号探针的浓度为100nM。较佳地，所述预杂交在60～100℃保持1～10分钟，然后20～40℃放置5～60分钟。更佳地，所述预杂交的温度为80℃。更佳地，所述预杂交的时间为5分钟。较佳地，所述放置的时间为20分钟。较佳地，所述放置的温度为25℃。较佳地，所述预杂交在缓冲液下进行。所述缓冲液为本领域常规的缓冲液，较佳地，所述缓冲液为包含1MNaCl的10mMTE缓冲溶液，所述TE缓冲液包括10mMTris-HCl和1mMEDTA，pH7.0。本专利技术中，步骤(Ⅱ)为：将步骤(Ⅰ)所得的预杂交物A与所述的电化学生物传感器的电极上的DNA捕获探针杂交，得杂交的电极。其中，较佳地，步骤(Ⅱ)所述的杂交在25～45℃杂交30～120分钟；更佳地，所述杂交的温度为37℃。较佳地，所述杂交的时间为60分钟。较佳地，所述杂交完成后还包括清洗电极的步骤。所述清洗的清洗液是本领域常规的清洗液，较佳地，为含有1MNaCl的10mMTE缓冲溶液，所述TE缓冲液包括10mMTris-HCl和1mMEDTA，pH7.0。本专利技术中，步骤(Ⅲ)为：向步骤(Ⅱ)所得的杂交的电极上滴加亲和素-辣根过氧化酶(avidin-HRP酶)后孵化；加入底物TMB，进行检测分析。其中，较佳地，所述的亲和素-辣根过氧化酶为1000倍稀释的亲和素-辣根过氧化酶；较佳地，所述1000倍本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于多腺嘌呤的DNA捕获探针，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示。
【技术特征摘要】
1.一种基于多腺嘌呤的DNA捕获探针，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示。2.一种电化学生物传感器，其特征在于，其由包括以下步骤的方法制备而成：(1)制备基于多腺嘌呤的DNA捕获探针，所述DNA捕获探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示；(2)将步骤(1)所得的基于多腺嘌呤的DNA捕获探针滴加到电极上，反应，得组装电极；(3)用巯基己醇对步骤(2)所得的组装电极的空位封闭，得封闭的电极。3.如权利要求2所述的电化学生物传感器，其特征在于，步骤(1)中所述的DNA捕获探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；或者，步骤(2)所述基于多腺嘌呤的DNA捕获探针滴加到电极上时的组装密度为0.01～3μM，较佳地为0.1μM；或者，步骤(2)所述反应的温度为20～40℃，较佳地为25℃；或者，步骤(2)所述组装的时间大于12小时；或者，步骤(2)所述电极由包括以下步骤的方法制得：经物理打磨、硫酸电化学清洗，再用超纯水彻底冲洗电极表面，然后用N2吹干；或者，步骤(3)所述巯基己醇的浓度为0.01～1mM，较佳地为0.1mM；或者，步骤(3)所述空位封闭的时间为5～60分钟，较佳地为30分钟；或者，步骤(3)所述空位封闭的温度为25℃。4.如权利要求3所述的电化学生物传感器，其特征在于，步骤(2)中所述的组装密度为0.1μM，步骤(3)所述巯基己醇的浓度为0.1mM，封闭时间为30min。5.一种利用如权利要求2～4任一项所述的电化学生物传感器检测待测DNA的方法，其包括以下的步骤：(Ⅰ)将待测DNA和核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.7所示且在3’端连接生物素的信号探针预杂交，得预杂交物A；(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)所得的...
【专利技术属性】
技术研发人员：李兰英，闻艳丽，刘刚，王乐乐，徐勤，梁文，
申请(专利权)人：上海市计量测试技术研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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