一种纳米粒在细胞和组织内分布的检测方法及其应用技术

本发明专利技术属于医药生物领域，具体涉及一种纳米粒细胞内和组织内分布的检测方法。本发明专利技术通过使用纳米颗粒跟踪分析技术，提供了一种简单可靠的定性和/或定量检测方法，评价细胞对纳米粒的摄取情况，以及纳米粒在体内组织中的分布。通过将纳米粒进行荧光标记，用分离手段，对进入组织器官内纳米粒的数量和粒径进行针对性的分析，以考察纳米粒在体内的动态变化。本发明专利技术的检测方法具有操作简单、节约时间、提供有效数据多等特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药生物领域，特别是涉及一种纳米粒在细胞和组织内分布的检测方法及其应用。
技术介绍
纳米粒进入体内后，与体液中的蛋白(白蛋白、脂蛋白、免疫球蛋白等)、细胞(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)发生复杂的相互作用，从而导致纳米粒在形态、表面性质以及数量的变化。用于检测的常规手段包括流式细胞仪、激光共聚焦显微镜，但过程复杂而繁琐，提供的数据结果也无法量化，不能精确的展现出纳米粒自身的状态。由于血清蛋白、血细胞等的干扰，用于纳米粒分析的常规仪器如DLS也显得乏力。本专利技术应用纳米颗粒跟踪分析技术，对纳米粒的粒径以及颗粒数进行测定。同时，还可以通过对复杂体系中的特定纳米颗粒进行荧光标记，排除组分中其他粒子的干扰，使得检测结果更有针对性，荧光通道下的检测视野如图1所示。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种一种纳米粒细胞内和组织内分布的检测方法。本专利技术通过使用纳米颗粒跟踪分析技术，提供了一种简单可靠的定性和/或定量检测方法，评价细胞对纳米粒的摄取情况，以及纳米粒在体内组织中的分布。通过将纳米粒进行荧光标记，用分离手段，对进入组织器官内纳米粒的数量和粒径进行针对性的分析，以考察纳米粒在体内的动态变化。本专利技术的检测方法具有操作简单、节约时间、提供有效数据多等特点。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术第一方面提供一种纳米粒在细胞内分布的检测方法，包括如下步骤：1)纳米粒进行荧光标记；2)将步骤1)得到的荧光标记的纳米粒与细胞共孵育；3)将步骤2)得到的细胞分离得到上清；4)将步骤3)得到的上清采用纳米颗粒跟踪分析仪进行定性和/或定量检测；5)根据上清中纳米颗粒定性和/或定量检测的结果，获取纳米粒在细胞内分布状况。优选地，步骤2)中，将步骤1)得到的荧光标记的纳米粒与介质孵育后，再加入到细胞内孵育，所述介质为PBS、白蛋白溶液或血清。更优选，所述荧光标记的纳米粒与所述介质的体积比为0.5～1:1。优选地，步骤3)中，所述分离为：先梯度离心分离，再qEV分离柱分离。所述细胞可为外周血细胞或肿瘤细胞。所述纳米粒包括脂质体、自组装纳米粒、纳米复合物、外泌体等纳米级别的颗粒。优选地，步骤4)中，所述定性方法为：采用纳米颗粒跟踪分析仪获得上清中剩余纳米粒的量，与总纳米粒相比，来确认纳米粒是否被细胞摄取。优选地，步骤4)中，所述定量方法为：采用纳米颗粒跟踪分析仪获得上清中剩余纳米粒的量，总纳米粒与剩余纳米粒的量的差为纳米粒被细胞摄取的量。更优选地，所述纳米颗粒跟踪分析仪为搭载532nm激光器的NTANS300，切换至荧光通道检测模块，特异性的检测荧光标记纳米粒的粒径及其数量。本专利技术第二方面提供上述纳米粒在细胞内分布的检测方法用于观测纳米粒被不同外周血细胞或肿瘤细胞的摄取状态。本专利技术第三方面提供一种纳米粒在组织内分布的检测方法，包括如下步骤：1)纳米粒进行荧光标记；2)将步骤1)得到的荧光标记的纳米粒注入组织；可以将步骤1)得到的荧光标记的纳米粒注入离体的组织样本，也可以将步骤1)得到的荧光标记的纳米粒注入个体，如动物或植物；3)将步骤2)得到的组织分离得到上清；当步骤2)为将步骤1)得到的荧光标记的纳米粒注入个体时，步骤3)中所述步骤2)得到的组织需要先从个体中取出；4)将步骤3)得到的上清采用纳米颗粒跟踪分析仪分进行定性和/或定量检测；5)根据上清中纳米颗粒定性和/或定量检测的结果，获取纳米粒在组织内分布状况。所述组织可为肿瘤组织、肝脏组织、脾脏组织、肾脏组织或肠道组织。优选地，步骤3)中，所述分离为：将步骤2)得到的组织加入dispase溶液裂解为单细胞悬液，消化组织，然后离心，取上清过qEV分离柱分离。更优选地，加入dispase溶液的浓度为0.6-2.4U/mL，加入量为每50mg组织加入750μLdispase溶液。优选地，步骤4)中，所述定性方法为：采用纳米颗粒跟踪分析仪获得上清中剩余纳米粒的量，与总纳米粒相比，来确认纳米粒是否被组织摄取。优选地，步骤4)中，所述定量方法为：采用纳米颗粒跟踪分析仪获得上清中剩余纳米粒的量，总纳米粒与剩余纳米粒的量的差为纳米粒被组织摄取的量。更优选地，所述纳米颗粒跟踪分析仪为搭载532nm激光器的NTANS300，切换至荧光通道检测模块，特异性的检测荧光标记纳米粒的粒径及其数量，屏蔽组织处理过程中引入以及本身存在的纳米级颗粒的影响。本专利技术第四方面提供一种上述纳米粒在组织内分布的检测方法的用途，用于观测纳米粒在动物体内的组织分布。本专利技术提供了一种简单可靠的定性和/或定量检测方法，评价细胞对纳米粒的摄取情况，以及纳米粒在体内组织中的分布。通过将纳米粒进行荧光标记，用分离手段，对进入组织器官内纳米粒的数量和粒径进行针对性的分析，以考察纳米粒在体内的动态变化。本专利技术的检测方法具有操作简单、节约时间、提供有效数据多等特点。附图说明图1是Nanosight荧光通道下检测纳米粒视野图。图2是制备好的荧光纳米粒在DLSNanosizer粒径图。图3是组织中分离的纳米粒在Nanosight检测结果。图4是细胞在不同介质中对纳米粒摄取的流式细胞仪检测图。图5是纳米粒从肿瘤组织中回收的标准曲线。图6是纳米粒在组织处理过程中回收的标准曲线。图7是纳米粒在肿瘤组织中的数量随时间变化曲线。图8是纳米粒在肝脏组织中的数量随时间变化曲线。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本专利技术中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本专利技术中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本专利技术可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更
技术实现思路
的情况下，当亦视为本专利技术可实施的范畴。本专利技术中，缩写符号表示如下：缩写名称中文全称HSPC氢化大豆卵磷脂Chol胆固醇DSPE-PEG2000二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000DiI细胞膜红色荧光探针PBS磷酸盐缓冲溶液NTANS300纳米颗粒跟踪分析仪DLS马尔文激光粒度仪PLD空白阿霉素脂质体Alb血清白蛋白FBS小牛血清Raw246.7巨噬细胞系dispase溶液中性蛋白酶实施例1纳米粒被细胞摄取的量化检测(一)荧光纳米粒的制备本专利技术采用脂质体作为纳米粒的模型。取HSPC、Chol、DSPE-PEG2000储备液质量比为3：1：1，按脂质质量比1％加入DiI，用乙醇注入法制备脂质体，PBS水合30min后，在60℃分别过200nm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纳米粒在细胞内分布的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)纳米粒进行荧光标记；2)将步骤1)得到的荧光标记的纳米粒与细胞共孵育；3)将步骤2)得到的细胞分离得到上清；4)将步骤3)得到的上清采用纳米颗粒跟踪分析仪进行定性和/或定量检测；5)根据上清中纳米颗粒定性和/或定量检测的结果，获取纳米粒在细胞内分布状况。

【技术特征摘要】
1.一种纳米粒在细胞内分布的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)纳米粒进行荧光标记；2)将步骤1)得到的荧光标记的纳米粒与细胞共孵育；3)将步骤2)得到的细胞分离得到上清；4)将步骤3)得到的上清采用纳米颗粒跟踪分析仪进行定性和/或定量检测；5)根据上清中纳米颗粒定性和/或定量检测的结果，获取纳米粒在细胞内分布状况。2.如权利要求1所述的纳米粒在细胞内分布的检测方法，其特征在于，步骤2)中，将步骤1)得到的荧光标记的纳米粒与介质孵育后，再与细胞共孵育，所述介质为PBS、白蛋白溶液或血清。3.如权利要求2所述的纳米粒在细胞内分布的检测方法，其特征在于，所述荧光标记的纳米粒与所述介质的体积比为0.5～1:1。4.如权利要求1所述的纳米粒在细胞内分布的检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述分离为：先梯度离心分离，再qEV分离柱分离。5.如权利要求1至4中任一项所述的纳米粒在细胞内分布的检测方法用于观测纳米粒被...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐宇虹，许风伟，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31