研究人体无精症和严重少精症快速检测的方法及应用其方法的试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种人体无精症和严重少精症检测方法的研究，提供了一种研究人体无精症和严重少精症快速测试的方法，包括：样品收集，样品处理及利用real‑time PCR平台诊断和利用样品处理的结果进行ELISA检测。本发明专利技术还提供应用上述方法的试剂盒，该试剂盒包含上述样品处理后提取的RNAs和组织代谢物。本发明专利技术提供的研究方法帮助人体无精症和严重少精症患者快速检测及诊断，本发明专利技术提供的试剂盒可以帮助患者更快的找到病因进行治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种人体精子的检测研究领域，特别涉及人体无精症和严重少精症检测方法的研究及应用该方法的试剂盒。
技术介绍
据统计，育龄夫妇一年内不能怀孕者占25％以上，其中男方因素引起的不育约50％，然而，男性不育病因复杂，30％以上由遗传缺陷导致生精障碍引起，其表现为无精子症和严重少精子症。男性生精障碍的病因正日益受到重视，但由于生精过程的复杂性，长期以来对精子发生的病理生理认识不足，导致这部分患者诊疗及预后判断上的困难。目前，临床大部分无精子症和严重少精子症患者生精障碍的病因未明，给临床治疗带来了极大的困惑，因此，有必要对不明原因生精障碍的机制进行系统研究，筛选无精子症和严重少精子症特异性标志物，研究相关检测技术，为男性不育患者临床快速准确分型和个性化治疗提供依据，减少无效或不必要的检查与治疗。现有技术对无精子症和严重少精子症的临床检测方法主要有染色体核型分析和AZF微缺失检测，但这两项技术检测耗时长、效率低且仅能解释少数患者(5％-15％)生精障碍的原因。因此，有必要对能快速检测人体无精子症和严重少精子症的方法进行研究及其提供一种应用此方法的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种研究能快速检测人体无精子和严重少精子症的方法。本专利技术另一目的在于提供用于该方法的试剂盒。本专利技术的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本专利技术提出的一种研究人体无精症和严重少精症快速测试的方法，其步骤包括：a)提取相同等份严重少精症/无精症患者和正常男性的血液、精浆、尿液样本，及提取所述相同等份严重少精症/无精症患者和正常男性睾丸中的睾丸组织和液氮，进行保存；提取相同等份严重少精症/无精症患者和正常男性的血液、精浆、尿液样本，及提取所述相同等份严重少精症/无精症患者和正常男性睾丸中的睾丸组织和液氮，进行保存；b)样品处理，包括：精浆处理、尿液处理和睾丸组织处理，其中，所述精浆处理是指首先将精液进行离心处理、收集上清，提取精浆中总蛋白，再用蛋白组学方法获取不同类型群体精浆的差异蛋白，最后用western blotting方法对差异蛋白进行验证；所述尿液处理是指首先将收集到的尿液进行离心处理，去除杂质，再用代谢组学方法检测不同类型群体尿液代谢产物差异；所述睾丸组织处理是指采集的睾丸组织从RNA保护液中取出，再用提取RNAs，然后利用miRCURY LNA expression array方法进行差异microRNA的鉴定。最后用real-time PCR方法进一步验证差异microRNA的表达。c)根据差异基因的表达，利用real-timePCR平台诊断及利用所述精浆中差异蛋白或所述尿液中的差异代谢产物的结果进行ELISA检测。进一步地，还包括有蛋白标记，是指所述蛋白相对表达量用扫描积分光密度值表示，差异点标记为两组间量升高或者降低2倍者，且每个样品均重复5次，选取凝胶上分析的差异蛋白点，同时选一空白胶作为对照，将切下的胶点放入具有微量水的离心管中，进行HDMS鉴定。更优地，所述样品的数量最好为300个。本专利技术还提出了一种应用上述方法得到的试剂盒，所述试剂盒包括所述睾丸组织处理后提取的RNAS或组织的代谢物。本专利技术提供的研究人体无精症和严重少精症快速测试的方法，结合了microRNA技术，利用无精症和严重少精症特异性标志物，如精浆、尿液等进行检测，相对现有临床检测方法(如染色体核型分析和AZF微缺失分析检测)而言，具有快速，效率高等特点。具体实施方式本专利技术提出的是一种研究人体无精症和严重少精症快速测试的方法，步骤包括：1，样本收集：提取相同等份严重少精症/无精症患者和正常男性的血液、精浆、尿液样本，及提取所述相同等份严重少精症/无精症患者和正常男性睾丸中的睾丸组织和液氮，进行保存，在本实施例中，睾丸组织的采集通过采用行睾丸穿针术来采集的；2，样品进行处理，包括：精浆处理、尿液处理、睾丸组织处理；其中精浆处理是指首先将精液进行离心处理、收集上清、提取精浆的差异蛋白，最后用western blotting方法对差异蛋白进行验证，在一些实施例中，蛋白标记是指，蛋白的相对表达量用扫描积分光密度值表示，差异点标记为两组间量升高或降低者，且每个样品均重复5次，选取凝胶上分析的差异蛋白点，同时选一空白胶作为对照，将切下的胶点放入具有微量水的离心管中，进行HDMS鉴定。尿液处理是指首先将收集到的尿液进行离心处理，去除杂质，再用代谢学方法检测不同类型群体尿液代谢差异。睾丸组织处理是指采用的睾丸组织从RNA保护液中取出，再用提取RNAs，然后利用miRCURY LNA expression array方法进行差异microRNA的鉴定，最后用real-time PCR方法进一步验证差异microRNA的表达。3，根据差异基因的表达，利用real-time PCR平台诊断及利用所述精浆中差异蛋白或所述尿液中的差异代谢产物的结果进行ELISA检测。本实施例中所说的差异蛋白是利用蛋白组学方法寻找正常男性和不育男性也就是说严重少精症和无精症患者的精浆中差异标记的蛋白，同样，差异代谢物也是说利用代谢组学，筛选正常男性和不育男性的尿液中代谢产物的差异，而差异microRNA表达是通过芯片方法筛选正常男性和不育男性睾丸组织中的差异microRNA的表达，本实施例的芯片方法主要是指利用miRCURY LNA expression array方法进行差异microRNA的鉴定。在其他的实施例中可以用到其他相同功能的差异寻找方法或芯片方法来得到差异蛋白、差异代谢物及差异microRNA的表达。最优的实施方式中，样品的数量选择为严重少精症、无精症皇者和正常男性各300例，且检测血尿常规、精液常规及血激素水平无异常，收集其样品。同时，本实施例还提供了一种应用以上研究人体无精症和严重少精症快速检测的方法的试剂盒，该试剂盒中具有以上方法提取的RNAs或者组织代谢物，其他实施方式中可以有从样本中提取的其他特一定物质。通过本专利技术提供的这种研究方法，可以帮助人体无精症和严重少精症患者快速检测及诊断。本专利技术提供应用该方法的试剂盒同样也能起到帮助患者快速检测及诊断，及时查明病因。综上所述，尽管为说明目的已经公开了本专利技术的优选实施例，然而，本专利技术不只局限于如上所述的实施例，在不超出本专利技术基本技术思想的范畴内，相关行业的技术人员可对其进行多种变形及应用。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种研究人体无精症和严重少精症快速测试的方法，其步骤包括：a)样品收集：提取相同等份严重少精症/无精症患者和正常男性的血液、精浆、尿液样本，及提取所述相同等份严重少精症/无精症患者和正常男性睾丸中的睾丸组织和液氮，进行保存；b)样品处理，包括：精浆处理、尿液处理、睾丸组织处理；所述精浆处理是指首先将精液进行离心处理、收集上清，提取精浆中总蛋白，再用蛋白组学方法获取不同类型群体精浆的差异蛋白，最后用western blotting方法对差异蛋白进行验证；所述尿液处理是指首先将收集到的尿液进行离心处理，去除杂质，再用代谢组学方法检测不同类型群体尿液代谢产物差异；所述睾丸组织处理是指采集的睾丸组织从RNA保护液中取出，再用提取RNAs，然后利用miRCURY LNA expression array方法进行差异microRNA的鉴定，最后用real‑time PCR方法进一步验证差异microRNA的表达。c)根据差异基因的表达，利用real‑timePCR平台诊断及利用所述精浆中差异蛋白或所述尿液中的差异代谢产物的结果进行ELISA检测。

【技术特征摘要】
1.一种研究人体无精症和严重少精症快速测试的方法，其步骤包括：a)样品收集：提取相同等份严重少精症/无精症患者和正常男性的血液、精浆、尿液样本，及提取所述相同等份严重少精症/无精症患者和正常男性睾丸中的睾丸组织和液氮，进行保存；b)样品处理，包括：精浆处理、尿液处理、睾丸组织处理；所述精浆处理是指首先将精液进行离心处理、收集上清，提取精浆中总蛋白，再用蛋白组学方法获取不同类型群体精浆的差异蛋白，最后用western blotting方法对差异蛋白进行验证；所述尿液处理是指首先将收集到的尿液进行离心处理，去除杂质，再用代谢组学方法检测不同类型群体尿液代谢产物差异；所述睾丸组织处理是指采集的睾丸组织从RNA保护液中取出，再用提取RNAs，然后利用miRCURY LNA expression array方法进行差异microRNA的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑连文，徐影，代晓微，陈晓晨，郑晓宇，刘永正，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22