一种具有抗呼吸道合胞病毒活性的中药复方提取物制造技术

一种具有抗呼吸道合胞病毒活性的中药复方提取物，该复方由金银花、蒲公英、大青叶、板蓝根、赤芍、柴胡、秦艽、荆芥、淡竹叶组成，经水煎煮提取，聚酰胺树脂纯化得到提取物，其主要成分为黄酮，具有抗呼吸道合胞病毒的活性。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于医药卫生领域。
技术介绍
：呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是婴幼儿下呼吸道感染的最主要的病原，也老年人以及免疫缺陷人群下呼吸道感染的主要因素。RSV感染主要是损伤细支气管上皮细胞，导致小气道障碍、过度充气以及肺不张，可引起间质性肺炎及毛细支气管炎。疫苗是控制病毒性疾病最有效的防治手段，然而，RSV疫苗的研制已有40多年的历史，尤其是近年对RSV亚单位疫苗的研究已取得较大进展，但由于存在RSV疫苗导致Th1/Th2平衡紊乱等问题，目前仍然没有研发出有效RSV疫苗。因此，获得高效低毒的抗RSV药物成为防治该病毒扩散传播的主要任务。目前也没有针对专门针对RSV感染的有效治疗药物。广谱抗病毒药物利巴韦林是唯一可应用于RSV的小分子化学药物，由于存在作用机制不明、疗效不显著和毒副作用等问题，其在临床上的应用十分有限，而抗体药物RSV中和抗体起不到治疗作用，仅可以用于预防，很难普及应用。目前已有为数不多的专门针对RSV感染的候选药物处于临床试验阶段，包括抑制RSV包膜与宿主细胞膜融合过程的小分子药物GS-5806，siRNA药物ALN-RSV01)、核苷抑制剂ALS-8176和N蛋白抑制剂RSV604等。中医药在病毒病的防治方面具有独特的优势，现代临床与药理药效研究发现具有清热、解毒等功效的中药黄芩、连翘、败酱草、甘草等中药，痰热清、热毒宁、热毒清等中药复方和黄芩苷、白藜芦醇、西瑞香素、女贞子环烯醚萜苷、淡竹叶黄酮苷〔〕等成分或组分显示除了良好的抗呼吸道合胞病毒活性。其作用机制包括了抑制病毒复制和侵染细胞、提高抗病毒免疫活性、以及调节病毒感染宿主细胞炎性因子合成和释放等，充分体现了中药治疗疾病的多组分、多治疗靶点特点和优势。
技术实现思路
：一种具有抗呼吸道合胞病毒活性的中药复方提取物，其特征在于它包括以下几个方面：1.该复方由金银花、蒲公英、大青叶、板蓝根、赤芍、柴胡、秦艽、荆芥、淡竹叶组成。2.以权利要求1所述的药物比例为：1～3∶1～5∶2～4∶1～3∶1～2∶1～3∶2～5∶1～3∶1～4。3.以权利1、2所述的药物的提取工艺为：8～10倍量的水煎煮2～3次，每次0.5～1.5h，滤过的提取液。4.以权利3所述的药物的提取液的纯化工艺为：通过聚酰胺树脂柱，收集乙醇浓度为30～60％洗脱液，浓缩，干燥，即得。5.以权利4所述的药物提取物，以芦丁为对照，经比色法测定的总黄酮含量为60～70％。6.以权利4所述的药物提取物具有抗呼吸道合胞病毒的活性。实施例1具体实施方式实施例1：金银花、蒲公英、大青叶、板蓝根、赤芍、柴胡、秦艽、荆芥、淡竹叶按照比例：1∶2∶2∶3∶1∶2∶4∶3∶2进行配伍，共20kg，加水200L煎煮1h，滤过，滤渣加水160L煎煮0.5h，滤过，合并滤液，浓缩致20L，聚酰胺树脂分离，收集乙醇浓度为30％～60％的部位，减压浓缩，真空干燥，的提取物，以芦丁为对照品，经比色法测定的总黄酮含量为66.7％。实施例2：金银花、蒲公英、大青叶、板蓝根、赤芍、柴胡、秦艽、荆芥、淡竹叶按照比例：2∶1∶3∶2∶1∶2∶4∶3∶2进行配伍，共20kg，加水200L煎煮1.5h，滤过，滤渣加水160L煎煮1h，滤过，合并滤液，浓缩致20L， 聚酰胺树脂分离，收集乙醇浓度为30％～60％的部位，减压浓缩，真空干燥，的提取物，以芦丁为对照品，经比色法测定的总黄酮含量为65.3％。本专利技术的抗RSV活性如下： 药物：本专利技术的提取物(实施例1)含总黄酮66.7％。市售双黄连口服液，利巴韦林注射液。细胞株：Hep-2(人喉癌细胞)。病毒株：RSV A2。方法：1)细胞的复苏及培养RSV病毒冻存管从液氮罐取出，立即投入37℃～42℃温水中融化(遵循慢冻速溶原则)，超净工作台内将冻存管中液体移入离心管中，1000r/min，5min，弃冻存液，加入8mL浓度10％的1640细胞培养液轻轻将下层沉淀细胞吹打混匀，用移液管转移到培养瓶内，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。待细胞长成单层后进行传代。2)病毒的扩增 将RSV病毒接种于已经长成单层的Hep-2细胞上，加1640维持液8mL置37℃、5％CO2病毒培养箱中培养，并设细胞对照，逐日观察。待细胞出现80％以上的病变时，反复冻融3次，用吸管轻轻吹打，1000r/min，5min，取上清液定量分装于小青瓶中，胶布封口，放于-80℃冰箱冻存备用。3)病毒毒力的测定将病毒用1640维持液做10倍比系列稀释不同浓度，纵向重复4孔，依次接种于已长成单层的Hep-2细胞的96孔板中，同时设细胞对照。37℃、5％CO2病毒培养箱中培养，倒置显微镜下逐日观察，连续观察5d，将板孔内液体吸弃，加1％中性红50μL，37℃、5％CO2培养箱中1小时，弃染液，用洗液将多余染料充分洗漆，加脱色液100μL，室温脱色10min，用酶标仪在540mn波长测定OD值。根据Reed-Muench公式计算病毒液的半数感染浓度TCID50。细胞存活率＝各组OD值/正常细胞OD值×100％细胞病变率＝1-细胞存活率 细胞比距＝(高于50％病变率-50％)/(高于50％病变率-低于50％病变率)×100％TCID5o＝Antilg(Ig高于50％CPE百分率病毒稀释度+比距×稀释因子对数)4)药物对细胞毒性测定将小儿双金用1640维持液按二倍比稀释10个浓度梯度，依次接种于已经长成单层的Hep-2细胞的96孔板中，并设4个复孔及细胞对照孔；37℃、5％CO2培养箱中培养，逐日观察细胞病变，连续观察3d，计算药物的最大无毒浓度。细胞出现病变者判为药物毒性，中性红染色，用酶标仪在540mn波长测定OD值，应用Reed-Muench公式计算药物半数中毒浓度(TC50)，并确定最小无毒浓度(TC0)。TC50＝[Antilog(log高于50％CPE百分率病毒稀释度+比距)]×C5)抗RSV病毒实验提取物从无毒浓度起用1640二倍比系列稀释10个浓度，每孔50μL接种于已长成单层Hep-2细 胞的96板孔中，每孔再加入50μL RSV病毒液，同时设利巴韦林阳性对照组、双黄连对照组、病毒对照组及空白细胞对照组，每组4个复孔。5％CO2培养箱中培养，观察细胞病变，待病毒对照出现90％以上的病变时，1％中性红染色，并用酶标仪在540nm波长测定OD值。应用Reed-Muench方法计算药物半数有效浓度(EC50)和治疗指数(TI)。EC50＝[Antilog(log高于50％CPE百分率病毒稀释度的值-比距)]×CTI＝半数毒性浓度(TC50)/半数有效浓度(EC50)6)结果每日观察细胞病变情况，病毒感染24小时后病毒组开始出现病变，药物组也开始显现病变，细胞在无毒浓度范围内随着药物浓度的降低，RSV感染细胞表现明显，脱落或细胞间融合，变圆、肿胀、破碎，48小时病毒对照组90％病变，药物组几个浓度梯度孔被完全保护，细胞生长良好，双黄连组细胞形态完好。提取物TI＝16.7，双黄连TI＝20.1，利巴韦林TI＝9.9。本文档来自技高网...

【技术保护点】
该复方由金银花、蒲公英、大青叶、板蓝根、赤芍、柴胡、秦艽、荆芥、淡竹叶组成。

【技术特征摘要】
1.该复方由金银花、蒲公英、大青叶、板蓝根、赤芍、柴胡、秦艽、荆芥、淡竹叶组成。2.以权利要求1所述的药物比例为∶1～3∶1～5∶2～4∶1～3∶1～2∶1～3∶2～5∶1～3∶1～4。3.以权利1、2所述的药物的提取工艺为：8～10倍量的水煎煮2～3次，每次0.5～1....

【专利技术属性】
技术研发人员：田景振，崔清华，侯林，
申请(专利权)人：田景振，山东润华药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37