本发明专利技术公开了传染性皮下及造血器官坏死病毒LAMP引物、试剂盒及检测方法，其中所述引物包括：正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP，和反向内引物BIP。本发明专利技术的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种传染性皮下及造血器官坏死病毒LAMP引物；本发明专利技术的另一个目的是提供一种包含上述引物的试剂盒；本发明专利技术的另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测传染性皮下及造血器官坏死病毒的方法，该检测方法具有：引物特异性强，设备简单，快速、检测灵敏度高、闭管检测、操作简单、结果直接可以判读等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种传染性皮下及造血器官坏死病毒LAMP引物、本专利技术还涉及一种包括上述引物的试剂盒；本专利技术还涉及一种采用上述试剂盒检测传染性皮下及造血器官坏死病毒的方法。
技术介绍
传染性皮下及造血组织坏死病毒Infectioushypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV是世界各地养殖和野生对虾的重要病毒性病原之一。该病毒的感染宿主范围广,危害非常严重,对细角滨对虾Litopenaeus stylirostris有较高致病性,造成其幼体和仔虾高达90％的死亡率；而感染凡纳滨对虾L.vannamei可导致慢性矮小残缺综合症,使养殖对虾规格参差不齐,产量下降,造成10％～50％的经济损失。因此,国际兽疫局(OIE)将IHHNV引起的疾病列为必须报告的重要水生动物病毒性疫病之一,且该病毒普遍存在于我国的很多养殖对虾中。但是目前对IHHNV引起的对虾病害尚无有效的治疗方法,只能预防,避免与病毒病原体的接触是最有效的预防措施,而这又主要依赖于早期的快速诊断，但是该病毒在对虾体内含量低，所以必须研究高灵敏度的检测方法。PCR检测技术具有快速、灵敏、特异性强的特点，已被广泛应用于动植物和人类等病原物的检测。因此,建立IHHNV快速、有效、准确的检测和诊断技术是预防此类疫病的重要技术手段之一。近年来各种基于免疫学的方法或基于PCR的方法已被用于IHHNV的诊断检测。由于各种基于PCR的检测方法具有较高的敏感性和较好的特异性,应用最为广泛,是目前国际上公认的灵敏度较高和特异较好的分子检测方法,已应用到对虾IHHNV的检测，但是需要昂贵的设备和仪器，且需要经过专业训练的技术人员，这个问题一直困扰着一线的检测技术人员。因此还必须不断研究更为灵敏的检测方法，才能将该病毒传播的可能性降到最低限。而且对于这个病毒，由于其带毒率非常低，故需要灵敏度非常高的检测方法才能将潜在的病毒检测出来，所以急需研究新的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种传染性皮下及造血器官坏死病毒LAMP引物；本专利技术的另一个目的是提供一种包含上述引物的试剂盒；本专利技术的另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测传染性皮下及造血器官坏死病毒的方法，该检测方法具有：引物特异性强，设备简单，快速、检测灵敏度高、闭管检测、操作简单、结果直接可以判读等特点。为了达到上述目的，本专利技术采用以下方案：一种传染性皮下及造血器官坏死病毒LAMP引物，其特征在于包括：正向外引物F3：5’TGGCCTAGTAACAAGAACAG3’；反向外引物B3：5’GTAGTCTATATCCTTGTTTGTTGAT3’；正向内引物FIP：5’TTCTTCGAAGAGAGCGTAGGAC-GAGACTCAAACACCTTCCAT3’；其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：F1c：5’TTCTTCGAAGAGAGCGTAGGAC3’；F2：5’GAGACTCAAACACCTTCCAT3’；反向内引物BIP：5’CTTCAAACTCCTTTTCGAAGGATCA-TCGTCCCATAATTTCTGACTC3’；其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：其中B1c：5’CTTCAAACTCCTTTTCGAAGGATCA3’；B2:5’TCGTCCCATAATTTCTGACTC3’。本专利技术一种传染性皮下及造血器官坏死病毒LAMP试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：其中所述引物包括：正向外引物F3：5’TGGCCTAGTAACAAGAACAG3’；反向外引物B3：5’GTAGTCTATATCCTTGTTTGTTGAT3’；正向内引物FIP：5’TTCTTCGAAGAGAGCGTAGGAC-GAGACTCAAACACCTTCCAT3’；其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：F1c：5’TTCTTCGAAGAGAGCGTAGGAC3’；F2：5’GAGACTCAAACACCTTCCAT3’；反向内引物BIP：5’CTTCAAACTCCTTTTCGAAGGATCA-TCGTCCCATAATTTCTGACTC3’；其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：其中B1c：5’CTTCAAACTCCTTTTCGAAGGATCA3’；B2:5’TCGTCCCATAATTTCTGACTC3’；其中该试剂盒的产品规格：40次。本专利技术一种传染性皮下及造血器官坏死病毒LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：A、提取样品RNA；B、建立LAMP反应体系：按检测所需的反应量从权利要求2所述的试剂盒中分别取各种试剂，放入灭菌试管中，在冰上配制预混液；轻弹击灭菌试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在灭菌试管底部；20μL LAMP反应体包括：C、加样：在三个装有20μL LAMP反应体的灭菌试管中分别加入待检测的待检测样品RNA、阴性对照反应样品、阳性对照反应样品各5μL，使各自的总量达到25μL，盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在灭菌试管底部；其中阴性对照反应使用去离子水作为样品，阳性对照反应使用带有WSSV DNA的阳性对照，D、扩增：将步骤C中的灭菌试管放置在恒温器中，在60-65℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；E、检测：使用紫外线照射装置从灭菌试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。如上所述的传染性皮下及造血器官坏死病毒LAMP检测方法，其特征在于步骤A中所述提取样品RNA，具体按以下步骤提取：a1、取0.1g的IHHNV和WSSV感病组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；a2、清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；a3、结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；a4、清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；a5、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；a6、取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为BPMV和SMV的RNA。如上所述的传染性皮下及造血器官坏死病毒LAMP检测方法，其特征在于步骤E中紫外线照射装置的紫外线范围：波长240－260nm或350-370nm。如上所述的传染性皮下及造血器官坏死病毒LAMP检测方法，其特征在于所述引物中外引物与内引物的比例为l:2-1:10。如上所述的传染性皮下及造血器官坏死病毒LAMP检测方法，其特征在于所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向内引物FIP、0.2μl反向内引物BIP。如上所述的传染性皮下及造血器官坏死病毒LAMP检测方法，其特征在于步骤D中扩增温度优选为63℃。综上所述，本专利技术相对于现有技术其有益效果是：本专利技术采用磁珠法提取IHHNV的DNA并根据IHHNV主要株系的外壳蛋白编码基因设计了检测IHHNV外壳蛋白大亚基的LAMP扩增的通用型引物，且建立了IHHNV LAMP检测的体系，通过本体系可以在本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种传染性皮下及造血器官坏死病毒LAMP引物，其特征在于包括：正向外引物F3：5’TGGCCTAGTAACAAGAACAG3’；反向外引物B3：5’GTAGTCTATATCCTTGTTTGTTGAT3’；正向内引物FIP：5’TTCTTCGAAGAGAGCGTAGGAC‑GAGACTCAAACACCTTCCAT3’；其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：F1c：5’TTCTTCGAAGAGAGCGTAGGAC3’；F2：5’GAGACTCAAACACCTTCCAT3’；反向内引物BIP：5’CTTCAAACTCCTTTTCGAAGGATCA‑TCGTCCCATAATTTCTGACTC3’；其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：其中B1c：5’CTTCAAACTCCTTTTCGAAGGATCA3’；B2:5’TCGTCCCATAATTTCTGACTC3’。
【技术特征摘要】
1.一种传染性皮下及造血器官坏死病毒LAMP引物，其特征在于包括：正向外引物F3：5’TGGCCTAGTAACAAGAACAG3’；反向外引物B3：5’GTAGTCTATATCCTTGTTTGTTGAT3’；正向内引物FIP：5’TTCTTCGAAGAGAGCGTAGGAC-GAGACTCAAACACCTTCCAT3’；其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：F1c：5’TTCTTCGAAGAGAGCGTAGGAC3’；F2：5’GAGACTCAAACACCTTCCAT3’；反向内引物BIP：5’CTTCAAACTCCTTTTCGAAGGATCA-TCGTCCCATAATTTCTGACTC3’；其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：其中B1c：5’CTTCAAACTCCTTTTCGAAGGATCA3’；B2:5’TCGTCCCATAATTTCTGACTC3’。2.一种传染性皮下及造血器官坏死病毒LAMP试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：其中所述引物包括：正向外引物F3：5’TGGCCTAGTAACAAGAACAG3’；反向外引物B3：5’GTAGTCTATATCCTTGTTTGTTGAT3’；正向内引物FIP：5’TTCTTCGAAGAGAGCGTAGGAC-GAGACTCAAACACCTTCCAT3’；其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：F1c：5’TTCTTCGAAGAGAGCGTAGGAC3’；F2：5’GAGACTCAAACACCTTCCAT3’；反向内引物BIP：5’CTTCAAACTCCTTTTCGAAGGATCA-TCGTCCCATAATTTCTGACTC3’；其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：其中B1c：5’CTTCAAACTCCTTTTCGAAGGATCA3’；B2:5’TCGTCCCATAATTTCTGACTC3’；其中该试剂盒的产品规格：40次。3.一种传染性皮下及造血器官坏死病毒LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：A、提取样品RNA；B、建立LAMP反应体系：按检测所需的反应量从权利要求2所述的试剂盒中分别取各种试剂，放入灭菌试管中，在冰上配制预混液；轻弹击灭菌试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在灭菌试管...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈定虎，管维，
申请(专利权)人：陈定虎，
类型：发明
国别省市：广东;44
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