一种甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法技术

本发明专利技术涉及一种甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法，具体包括如下步骤：(1)游离小孢子的制备，(2)将制备好的小孢子加入含16％蔗糖的NLN‑13无激素液体培养基中，于30‑35℃暗培养8h，然后向其中加入等体积的含4％蔗糖、105mg/L秋水仙素NLN‑13无激素液体培养基，于30‑35℃继续暗培养24h，除去秋水仙素，加入含10％蔗糖的NLN‑13无激素液体培养基25℃恒温静置暗培养5天，最后加入13％蔗糖的NLN‑13无激素液体培养基，调节小孢子的密度为1个花蕾/mL，在25℃恒温静置暗培养至胚状体产生；(3)小孢子植株的培育。采用本发明专利技术方法不仅小孢子的诱导率高，且小孢子植株易于再生。

Method for culturing isolated microspore of Brassica napus

The invention relates to a method for culturing microspores of Brassica napus plants, and includes the following steps: (1) microspore preparation, (2) the microspore prepared containing 16% sucrose 13 NLN without hormone in the medium liquid, 30 to 35 DEG C dark culture 8h, and then to the added volume containing 4% sucrose, 13 105mg/L colchicine NLN medium without hormone liquid, in 30 35 DEG C to remove the dark culture 24h, colchicine, containing 10% sucrose 13 NLN hormone free liquid culture medium at 25 C static dark for 5 days, finally adding 13% sucrose NLN 13 no hormone in the medium of liquid, regulation of microspore density was 1 /mL in the bud, the constant temperature of 25 DEG C to static dark culture of embryogenesis; (3) cultivation of microspore plants. By adopting the method of the invention, the induction rate of microspore is high, and the microspore plant is easy to regenerate.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物组织培养技术，具体涉及一种甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法。
技术介绍
利用植物小孢子培养技术可以获得单倍体(Hapiods)或双单倍体(Doublehapiods)植株，这种植株是遗传研究及转基因研究的理想材料，在育种工作中具有极大的利用价值。而油菜小孢子胚状体诱导率低一直是限制该技术广泛应用的一个问题，虽然目前小孢子的诱导培养方法很多，其中以申请号为200810300457.9中国专利申请效果最好，但其需要在诱导过程中通过鉴定小孢子的膨大率对诱导材料进行了提前筛选，只有膨大率大于50％的材料才能产生胚，而膨大率小于50％的材料则很难活无法产生胚，因此从实质上将还是无法解决诱导率低的问题；因此，寻找一种诱导率高的甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法显得至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法，该方法不仅小孢子的诱导率高，且小孢子植株易于再生。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法，具体包括如下步骤：步骤一、游离小孢子的制备：在大田中选取开花3-7天的甘蓝型油菜花序，选择3.0-4.0mm的花蕾，将其放入滤布中，在无菌条件下用70％酒精消毒1min，然后用0.1％升汞消毒10min，无菌水冲洗3-5次，经清洗和灭菌后的花蕾放入pH为5.8-6.0、含质量浓度13％的蔗糖的B5无激素液体培养基中，轻压挤出小孢子，经300目尼龙网膜过滤到离心管里，于800rpm离心8min，去掉上清液；再加入相同的B5无激素液体培养基在同样转速下离心5min，去掉上清液，即得游离甘蓝型油菜小孢子；步骤二、小孢子胚状体的诱导：将制备好的甘蓝型油菜小孢子加入含质量浓度16％的蔗糖的NLN-13无激素液体培养基中，于30-35℃暗培养8h，然后向其中加入等体积的含质量浓度4％的蔗糖、含105mg/L秋水仙素的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基，于30-35℃继续暗培养24h，然后用不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基清洗离心，除去秋水仙素，然后加入相同培养基即不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基，25℃恒温静置暗培养5天，最后加入不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为13％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基，调节小孢子的密度为1个花蕾/mL，在25℃恒温静置暗培养至胚状体产生；步骤三、小孢子植株的培育：将产生胚状体的小孢子置于80rpm的摇床上、25℃条件下暗培养1-2周，然后将正常发育的小孢子胚转入含0.8％质量浓度的琼脂，3％质量浓度的蔗糖，0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤，0.02mg/L NAA且pH5.8-6.0的B5固体培养基中，置于22℃、16h光周期培养箱内培养，2-3周转换一次培养基直到植株生长成为正常不定芽苗，然后再转生根培养基和盆栽驯化，最后移栽大田。进一步的，其特征在于，步骤三种所述的B5固体培养基中还含有0.5％质量浓度的活性炭。进一步的，步骤一种所述花蕾为3.5mm。与现有技术相比，本专利技术所取得的有益效果如下：1、本专利技术在小孢子胚状体的诱导过程中，先采用含16％质量浓度的蔗糖的NLN-13无激素液体培养基中于30-35℃暗培养8h，然后向其中加入等体积的含4％质量浓度的蔗糖、105mg/L秋水仙素的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基，于30-35℃继续暗培养24h，然后用不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基清洗离心，除去秋水仙素，然后加入相同培养基即不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基，25℃恒温静置暗培养5天，最后加入不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为13％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基，调节小孢子的密度为1个花蕾/mL，在25℃恒温静置暗培养至胚状体产生；采用该方法培养基及培养条件及培养步骤能在很大程度上提高小孢子胚状体的诱导率而不需要鉴定小孢子的膨大率。2、本专利技术在小孢子植株的培养过程中，采用含0.8％质量浓度的琼脂，3％质量浓度的蔗糖，0.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤，0.5％质量浓度的活性炭，0.02mg/L NAA且pH5.8-6.0的B5固体培养基中，置于22℃、16h光周期培养箱内培养，该培养基更适合于采用上述诱导方法诱导得到的胚状体再生为植株。本专利技术通过对小孢子胚状体诱导条件进行摸索研究，寻找到了一种诱导率高的小孢子胚状体诱导方法，并通过对该胚状体再生植株的培养条件进行研究寻找到了最适合的小孢子植株再生条件。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细的叙述。实施例1一种甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法，具体包括如下步骤：步骤一、游离小孢子的制备：在大田中选取开花3-7天的甘蓝型油菜花序，选择3.2mm的花蕾，将其放入滤布中，在无菌条件下用70％质量浓度的酒精消毒1min，然后用0.1％质量浓度的升汞消毒10min，无菌水冲洗3-5次，经清洗和灭菌后的花蕾放入pH为5.9、含13％质量浓度的蔗糖的B5无激素液体培养基中，轻压挤出小孢子，经300目尼龙网膜过滤到离心管里，于800rpm离心8min，去掉上清液；再加入相同的B5无激素液体培养基在同样转速下离心5min，去掉上清液，即得游离小孢子；步骤二、小孢子胚状体的诱导：将制备好的甘蓝型油菜小孢子加入含16％质量浓度的蔗糖的NLN-13无激素液体培养基中于33℃暗培养8h，然后向其中加入等体积的含4％质量浓度的蔗糖、105mg/L秋水仙素的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基(pH5.9)，于33℃继续暗培养24h，然后用不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基(pH5.9)清洗离心，除去秋水仙素，然后加入相同培养基即不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基(pH5.9)，25℃恒温静置暗培养5天，最后加入不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为13％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基，调节小孢子的密度为1个花蕾/mL，在25℃恒温静置暗培养至胚状体产生；步骤三、小孢子植株的培育：将产生胚状体的小孢子置于80rpm的摇床上、25℃条件下暗培养10天，然后将正常发育的小孢子胚转入含0.8％质量浓度的琼脂，3％质量浓度的蔗糖，0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤，0.02mg/L NAA且pH5.9的B5固体培养基中，置于22℃、16h光周期培养箱内培养，2周转换一次培养基直到植株生长成为正常不定芽苗，然后再转生根培养基和盆栽驯化，最后移栽大田。实施例2一种甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法，具体包括如下步骤：步骤一、游离小孢子的制备：在大田中选取开花3-7天的甘蓝型油菜花序，选择3.5mm的花蕾，将其放入滤布中，在无菌条件下用70％质量浓度的酒精消毒1min，然后用0.1％质量浓度的升汞消毒10min，无菌水冲洗3-5次，经清洗和灭菌后的花蕾放入pH为5.9、含13％质量浓度的蔗糖的B5无激素液体培养基中，轻压挤出小孢子，经300目尼龙网本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法，其特征在于，具体包括如下步骤：步骤一、游离小孢子的制备：在大田中选取开花3‑7天的甘蓝型油菜花序，选择3.0‑4.0mm的花蕾，将其放入滤布中，在无菌条件下用70％质量浓度的酒精消毒1min，然后用0.1％升汞消毒10min，无菌水冲洗3‑5次，经清洗和灭菌后的花蕾放入pH为5.8‑6.0、含质量浓度13％的蔗糖的B5无激素液体培养基中，轻压挤出小孢子，经300目尼龙网膜过滤到离心管里，于800rpm离心8min，去掉上清液；再加入相同的B5无激素液体培养基在同样转速下离心5min，去掉上清液，即得游离甘蓝型油菜小孢子；步骤二、小孢子胚状体的诱导：将制备好的甘蓝型油菜小孢子加入含质量浓度16％的蔗糖的NLN‑13无激素液体培养基中，于30‑35℃暗培养8h，然后向其中加入等体积的含质量浓度4％的蔗糖，含105mg/L秋水仙素的全过滤灭菌的NLN‑13无激素液体培养基，于30‑35℃继续暗培养24h，然后用不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN‑13无激素液体培养基清洗离心，除去秋水仙素，然后加入相同培养基即不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN‑13无激素液体培养基，25℃恒温静置暗培养5天，最后加入不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为13％的全过滤灭菌的NLN‑13无激素液体培养基，调节小孢子的密度为1个花蕾/mL，在25℃恒温静置暗培养至胚状体产生；步骤三、小孢子植株的培育：将产生胚状体的小孢子置于80rpm的摇床上、25℃条件下暗培养1‑2周，然后将正常发育的小孢子胚转入含0.8％质量浓度的琼脂，3％质量浓度的蔗糖，0.5mg/L 6‑苄基氨基嘌呤，0.02mg/L NAA且pH5.8‑6.0的B5固体培养基中，置于22℃、16h光周期培养箱内培养，2‑3周转换一次培养基直到植株生长成为正常不定芽苗，然后再转生根培养基和盆栽驯化，最后移栽大田。...

【技术特征摘要】
1.一种甘蓝型油菜游离小孢子植株的培养方法，其特征在于，具体包括如下步骤：步骤一、游离小孢子的制备：在大田中选取开花3-7天的甘蓝型油菜花序，选择3.0-4.0mm的花蕾，将其放入滤布中，在无菌条件下用70％质量浓度的酒精消毒1min，然后用0.1％升汞消毒10min，无菌水冲洗3-5次，经清洗和灭菌后的花蕾放入pH为5.8-6.0、含质量浓度13％的蔗糖的B5无激素液体培养基中，轻压挤出小孢子，经300目尼龙网膜过滤到离心管里，于800rpm离心8min，去掉上清液；再加入相同的B5无激素液体培养基在同样转速下离心5min，去掉上清液，即得游离甘蓝型油菜小孢子；步骤二、小孢子胚状体的诱导：将制备好的甘蓝型油菜小孢子加入含质量浓度16％的蔗糖的NLN-13无激素液体培养基中，于30-35℃暗培养8h，然后向其中加入等体积的含质量浓度4％的蔗糖，含105mg/L秋水仙素的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基，于30-35℃继续暗培养24h，然后用不含秋水仙素且蔗糖质量浓度为10％的全过滤灭菌的NLN-13无激素液体培养基清洗离心，...

【专利技术属性】
技术研发人员：申志彬，申志恒，王亚辉，袁翠叶，达奇，赵新存，
申请(专利权)人：邢台市蔬菜种子公司，
类型：发明
国别省市：河北;13