一种用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术一种用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物及其制备方法和应用，特点是通过制备精子顶体反应底物卵透明带蛋白及荧光素结合的单分散微米级微球，借助荧光强度的变化对精子顶体酶活性进行检测，具体分为表面羧基化或是氨基化修饰的单分散微球准备、表面改性、蛋白多肽的荧光标记、荧光蛋白多肽与功能微球的偶联及精子顶体酶活性的检测，优点是通过高分子微球技术和蛋白标记偶联技术实现了在微球上进行蛋白酶切并进行酶活性的评估，主要应用于精子顶体酶活性的流式检测，可以实现精子顶体反应和顶体酶活性的同步检测，能更真实准确的对精子顶体功能进行评价。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及精子顶体酶活性检测技术，尤其是涉及一种用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物及其制备方法和应用。
技术介绍
人类精子进入女性生殖道后，必须经过一段成熟过程，获得受精能力，此期间精子所发生的一系列生理变化成为获能。获能后的精子穿过卵丘、放射冠，到达透明带时，经过精卵识别、质膜变化、顶体酶释放、透明带酶解，精子细胞核进入卵细胞与核相溶，这一系列复杂的过程构成了广义上的顶体反应，而狭义顶体反应主要包括透明带诱发的质膜融合与顶体酶的释放两个关键过程。目前的实验室研究以及临床诊断最关注的也是这两个过程的分子机制和临床检测。其中质膜融合主要检测方法是通过体外模拟诱发精子顶体膜发生变化，并利用特异性染色的方法进行观察，顶体酶释放过程主要关注释放出的酶的活性检测。目前国内外实验室已经建立了比较成熟的顶体反应检测方法，主要有考马斯亮蓝染色法、酸性磷酸酶检测法，而应用较为广泛的是荧光染色法，主要为金霉素染色法、荧光标记的豌豆凝集素或花生凝集素偶联法。其中豌豆凝集素法最早与1993年提出，花生凝集素法也于同年报道，随后逐渐改进完善，配合荧光显微镜和自动分析软件，成为目前临床检测最常用的方法。独立的顶体反应检测并不能反映顶体酶活性，而顶体酶的活性直接关系到透明带的溶解，是精卵融合的重要环节。顶体酶的检测早期多利用顶体酶抗体进行放射免疫法或荧光免疫法进行检测，通过观察精子顶体内顶体酶的数量判断精子受精能力。后来Kennedy等人首先报道了计算顶体酶水解Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐(BAPNA)底物效率的方法判断精子顶体酶的活性，此方法首先将精子裂解，再将裂解液置于加入含有水解底物BAPNA的检测管中，底物水解后的显色深浅，可通过分光光度计进行检测，计算吸光值检测顶体酶的水解活力。该方法得出指标更能反应精子顶体酶的生理功能，现已成为标准检测方法。因为精子样本中顶体酶本身的活性并不高为μIU级别，因此采用分光光度计或酶标仪检测光吸收值的方法存在灵敏度不够高难以准确定量的问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种实现精子顶体反应和精子顶体酶活性的同步检测，灵敏度高，检测速度快的用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物及其制备方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物，其结构通式如下：其中M为高分子材料制成的单分散微球，R1为功能结合键，R2为蛋白或多肽，P为荧光分子。所述的单分散微球的直径为1-50微米，材质为聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、二氧化硅(SiO2)、聚乳酸(PLA)或聚乳酸羟基乙酸聚合物(PLGA)，所述的单分散微球的外表面功能化修饰羧基、氨基、羟基或巯基后，再对其表面进行聚乙二醇(PEG)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或Fe3O4的涂层修饰改性。所述的功能结合键为羧基与氨基结合的酰胺键或者羟基与羧基缩合键或者巯基与羟基缩合键。所述的R2为含精氨酸、赖氨酸的多肽或者卵透明带蛋白的全序列蛋白、片段或者牛血清白蛋白的全序列蛋白、片段。所述的荧光分子为偶联的荧光染料，所述的荧光染料为异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸盐罗丹明B(RBITC)、四乙基罗丹明(RIB200)，四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)，罗丹明红-X(Red-X)，德克萨斯红(Texas Red，)，藻红蛋白(AlexaFluor 488，PE)，藻红蛋白/德克萨斯红串联染料(PE-TR)，藻红蛋白/Alexa Fluor 610串联染料(PE-Alexa Fluor610)，藻红蛋白/Alexa Fluor647串联染料(PE-Alexa Fluor647)，藻红蛋白/花青染料5串联染料(PE-cy5)，藻红蛋白/花青染料5.5串联染料(PE-cy5.5)，藻红蛋白/Alexa Fluor 700串联染料(PE-Alexa Fluor 700)，藻红蛋白/花青染料7串联染料(PE-Cy7)，藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)，藻蓝蛋白/花青染料5.5串联染料(APC-Cy5.5)，藻蓝蛋白/花青染料7串联染料(APC-Cy7)，花青染料(Cy2/3/5)。上述用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物的制备方法，具体制备方法如下：(1)蛋白荧光标记将荧光分子异硫氰酸荧光素或异硫氰酸盐罗丹明B或四甲基异硫氰酸罗丹明溶于二甲基亚砜中配置成浓度为10mg/mL的荧光分子溶液，将卵透明带蛋白(ZP3)的全序列蛋白、片段或牛血清白蛋白的全序列蛋白、片段或含精氨酸、赖氨酸的多肽溶于碳酸盐缓冲液中配置成10mg/ml的R2溶液，将荧光分子溶液与R2溶液混合后，于4℃避光偶联反应16小时得到荧光蛋白溶液，将偶联后的荧光蛋白溶液加入预先用磷酸盐缓冲液洗涤的葡聚糖分离柱上，然后采用磷酸盐缓冲液以20ul/s低速进行柱分离，收集最先流出的褐色的液体(495nm有吸收值)得到荧光标记R2溶液，并定量计算蛋白或多肽浓度；其中R2溶液中所含蛋白或多肽分子与荧光分子溶液中荧光分子的摩尔比为(1∶9)-(1∶11)；(2)荧光标记蛋白与单分散微球偶联将浓度为50mg/mL的碳二亚胺(EDC)溶液和浓度为50mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液分别加入到浓度为0.01wt％的羧基化单分散微球溶液中，室温避光反应10-15分钟，然后涡旋震荡混匀1次后，继续室温避光反应10分钟，然后将反应溶液离心去上清后加入浓度为1mg/mL的荧光标记R2溶液，37℃避光震荡反应3小时，用含0.02wt％吐温-20的PBS溶液将微球离心洗涤3次，得到用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物；或者将浓度为50mg/mL的碳二亚胺(EDC)溶液和浓度为50mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液分别加入到浓度为1mg/mL的荧光标记R2溶液中，室温避光反应10-15分钟，然后涡旋震荡混匀1次后，继续室温避光反应10分钟，然后将反应溶液离心去上清后加入浓度为0.01wt％的氨基化单分散微球溶液中，37℃避光震荡反应3小时，用含0.02wt％吐温-20的PBS溶液将微球离心洗涤3次，得到用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物；其结构通式如下：其中M为直径为1-50微米的单分散微球，材质为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、二氧化硅、聚乳酸或聚乳酸羟基乙酸聚合物，所述的单分散微球的外表面功能化修饰羧基、氨基、羟基或巯基后，再对表面进行聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯或Fe3O4的涂层修饰改性；R1为酰胺键，R2为蛋白或多肽，P为荧光分子。所述的碳二亚胺(EDC)溶液、所述的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液、所述的单分散微球和荧光标记R2溶液的体积比为1∶1∶8∶8。上述用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物的制备方法，具体制备方法如下：(1)蛋白荧光标记称取1g RB200荧光素及2g五氯化磷放在乳钵中于通风橱中研磨5min后，加入10ml无水丙酮，不断搅拌，5min后过滤，用滤液进行标记标记蛋白或多肽，得到荧光分子溶液；将浓度为20mg/ml的卵透明带蛋白溶液、生理盐水与0.1mol/L pH 9.0的碳酸盐缓冲液按体积比1∶1∶1的比例混合后得到R本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物，其特征在于其结构通式如下：其中M为高分子材料制成的单分散微球，R1为功能结合键，R2为蛋白或多肽，P为荧光分子。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物，其特征在于其结构通式如下：其中M为高分子材料制成的单分散微球，R1为功能结合键，R2为蛋白或多肽，P为荧光分子。2.根据权利要求1所述的一种用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物，其特征在于：所述的单分散微球的直径为1-50微米，材质为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、二氧化硅、聚乳酸或聚乳酸羟基乙酸聚合物，所述的单分散微球的外表面功能化修饰羧基、氨基、羟基或巯基后，再对其表面进行聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯或Fe3O4的涂层修饰改性。3.根据权利要求1所述的一种用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物，其特征在于：所述的功能结合键为羧基与氨基结合的酰胺键或者羟基与羧基缩合键或者巯基与羟基缩合键。4.根据权利要求1所述的一种用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物，其特征在于：所述的R2为含精氨酸、赖氨酸的多肽或者卵透明带蛋白的全序列蛋白、片段或者牛血清白蛋白的全序列蛋白、片段。5.根据权利要求1所述的一种用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物，其特征在于：所述的荧光分子为偶联的荧光染料，所述的荧光染料为异硫氰酸荧光素、异硫氰酸盐罗丹明B、四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明，罗丹明红-X，德克萨斯红，藻红蛋白，藻红蛋白/德克萨斯红串联染料，藻红蛋白/Alexa Fluor 610串联染料，藻红蛋白/Alexa Fluor 647串联染料，藻红蛋白/花青染料5串联染料，藻红蛋白/花青染料5.5串联染料，藻红蛋白/Alexa Fluor 700串联染料，藻红蛋白/花青染料7串联染料，藻蓝蛋白，藻蓝蛋白/花青染料5.5串联染料，藻蓝蛋白/花青染料7串联染料，花青染料。6.一种权利要求1所述的用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物的制备方法，其特征在于具体制备方法如下：(1)蛋白荧光标记将荧光分子异硫氰酸荧光素或异硫氰酸盐罗丹明B或四甲基异硫氰酸罗丹明溶于二甲基亚砜中配置成浓度为10mg/mL的荧光分子溶液，将卵透明带蛋白的全序列蛋白、片段或牛血清白蛋白的全序列蛋白、片段或含精氨酸、赖氨酸的多肽溶于碳酸盐缓冲液中配置成10mg/ml的R2溶液，将荧光分子溶液与R2溶液混合后，于4℃避光偶联反应16小时得到荧光蛋白溶液，将偶联后的荧光蛋白溶液加入预先用磷酸盐缓冲液洗涤的葡聚糖分离柱上，然后采用磷酸盐缓冲液以20ul/s低速进行柱分离，收集最先流出的褐色的液体得到荧光标记R2溶液，并定量计算蛋白或多肽浓度；其中R2溶液中所含蛋白或多肽分子与荧光分子溶液中荧光分子的摩尔比为(1∶9)-(1∶11)；(2)荧光标记蛋白与单分散微球偶联将浓度为50mg/mL的碳二亚胺溶液和浓度为50mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液分别加入到浓度为0.01wt％的羧基化单分散微球溶液中，室温避光反应10-15分钟，然后涡旋震荡混匀1次后，继续室温避光反应10分钟，然后将反应溶液离心去上清后加入浓度为1mg/mL的荧光标记R2溶液，37℃避光震荡反应3小时，用含0.02wt％吐温-20的PBS溶液将微球离心洗涤3次，得到用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物；或者将浓度为50mg/mL的碳二亚胺溶液和浓度为50mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液分别加入到浓度为1mg/mL的荧光标记R2溶液中，室温避光反应10-15分钟，然后涡旋震荡混匀1次后，继续室温避光反应10分钟，然后将反应溶液离心去上清后加入浓度为0.01wt％的氨基化单分散微球溶液中，37℃避光震荡反应3小时，用含0.02wt％吐温-20的PBS溶液将微球离心洗涤3次，得到用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物；其结构通式如下：其中M为直径为1-50微米的单分散微球，材质为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾桥，许毅，李翼飞，李德才，房海燕，薛金锋，
申请(专利权)人：浙江星博生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33