质谱导向分离贝母属植物中环巴胺类似物的方法技术

本发明专利技术涉及质谱导向分离贝母属植物中环巴胺类似物的方法，具体涉及以介藜芦类异甾体生物碱对照品的共有产物离子为导向，通过引入LC‑QTOF‑MS/MS技术，建立了介藜芦类异甾体生物碱的快速表征方法，再借助LC‑QQQ‑MS/MS强大的筛选功能，从贝母属药材中筛选出了一系列环巴胺类似物，然后采用自动纯化系统根据馏分的质谱响应信号进行馏分的制备。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及天然药物的分离方法，公开了一种质谱导向分离贝母属植物中环巴胺类似物的方法。
技术介绍
环巴胺(Cyclopamine)是一种介藜芦类异甾体类生物碱，主要存在百合科植物伊贝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)、加州藜芦(Veratrum californicum)、毛叶藜芦(Veratrum grandiflorum)中。二十世纪60年代至80年代对环巴胺的研究仅限于致畸作用，但90年代中期的研究表明，环巴胺是一种hedgehog信号通路抑制剂，由于hedgehog信号通路的突变与多种肿瘤的发病有关联，因此环巴胺作为一种潜在的抗肿瘤新药在世界范围内掀起了研究热潮。近些年研究人员对环巴胺进行了更深入的研究，发现它对髓母细胞癌、胆管癌、卵巢癌、胰腺癌均显示出良好的抑制活性，并且美国Infinity制药公司开发的抗肿瘤药物环巴胺衍生物IPI-926已在2012年完成Ⅱ期临床试验。由于环巴胺、介芬胺等异甾体生物碱结构特殊，其全合成步骤长达20步总反应得率也仅为1％(Giannis,A.,Heretsch,P.,Sarli,V.,Stüβel,A.,Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,7911–7914.)，所以目前主要是用苯等有机溶剂提取再经柱层析、萃取除杂等步骤从加州藜芦中提取环巴胺，然而环巴胺在植物中含量低微，不到万分之一，且常规提取分离操作繁琐，得率较低，大量使用苯这种有毒试剂对环境、对研究人员也都有一定伤害，这在很大程度上限制了这一极具发展前景的抗肿瘤药物的继续深入研究。为提高产率，通常采用半合成的方式，先从植物中提取环巴胺类似物再半合成得到环巴胺，然后对得到的环巴胺进行结构修饰以期得到抗肿瘤活性较好的环巴胺衍生物。贝母属(Fritillaria)中最具代表性的环巴胺类似物是贝母辛(peimisine)，几乎每一种贝母都含有。目前从贝母属分离到的环巴胺类似物还包括：环巴胺(cyclopamine)、环坡素(cycloposine)、伊贝辛(yibeissine)、贝母辛-3-O-β-D-葡萄糖苷(peimisine-3-O-β-D-glucopyranoside)等等，这些类似物可以通过氧化还原反应或者去糖基化等反应半合成环巴胺。虽然异甾体生物碱在贝母属中种类繁多，但是对贝母属植物中介藜芦类异甾体生物碱的研究还远未开展。在天然产物化学研究领域，常规的“提取—分离—结构鉴定”仍然是主流的研究模式，对不同结构类型、不同含量分布的化合物缺乏与之相适应的“个性化”的技术手段与研究路线，分离过程常因周期长、缺乏导向性而导致具有重要生理活性和新颖骨架结构类型化合物发现的效率与几率偏低。针对这一问题，国内外研究人员当前的主要工作思路是：①开发新型分离介质以提高分离效率，如小粒子填料、微孔树脂、离子交换树脂等；②引入新的分离技术以适应特殊分离任务，如分子印迹技术(molecular imprinting technology,MIT)用于手性化合物的分离、疏水作用色谱(hydrophobic interaction chromatography,HIC)用于强极性成分的分离等；③发展各种联用技术，如高速逆流色谱-蒸发光散射检测(HSCCC-ELSD)、离心分配色谱-蒸发光散射检测(CPC-ELSD)等联用技术用于弱紫外吸收成分的制备分离。但是，如何增强分离过程的导向性和灵敏度，仍然没有切实可行的解决方案。因此，突破新化合物发现的传统研究模式，建立新颖结构类型天然产物的高效、快速、灵敏的分离分析方法，以提高新天然产物发现过程的效率、灵敏度和资源利用效率，是现今天然产物化学研究领域需要解决的重要科学问题之一。
技术实现思路
本专利技术针对介藜芦类异甾体生物碱在我国贝母属药用植物中“结构多样，含量低微”的分布特点，提出质谱快速表征-目标导向分离的研究方法。本专利技术首先采用高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(LC-QTOF-MS/MS)联用技术对环巴胺类似物进行质谱表征，根据质谱裂解规律提出诊断离子；然后，根据诊断离子采用高效液相色谱-三重四级杆质谱(LC-QQQ-MS/MS)联用技术筛选贝母属植物中的环巴胺类似物；接着，采用LC-QTOF-MS/MS验证贝母属中的环巴胺类似物；最后，根据筛选结果，选择资源量大、目标生物碱含量较高或含有新颖结构的品种，使用自动纯化系统导向分离环巴胺类似物。LC-QTOF-MS/MS可以通过四级杆质谱(MS1)预筛出一个母离子(precursor ion or parent ion)，然后以全扫描的方式记录产物离子(product ion)的质谱图，用飞行时间质谱(MS2)进行检测，母离子和产物离子均可获得准确分子量(质量准确度可小于2ppm，分辨率在10000以上)，可以用于天然产物中母离子和碎片离子的化学结构式推导。LC-QTOF-MS/MS集成液相色谱高分离效率、串联四级杆飞行时间质谱高灵敏度、高分辨率的功能为一体，在复杂天然产物的成分鉴定中正发挥着重要作用。LC-QQQ-MS/MS的母离子扫描(precursor ion scan)模式中的第一个四级杆Q1测定母离子，第三个四级杆Q3测定某个或几个特定的碎片离子，因此可以在非常复杂的混合物或药材提取液中检测到某种特定的分子。自动纯化系统以质谱作为引导制备目标化合物，抗干扰能力强，制备准确性高，可以针对药材中的目标分子量进行跟踪制备，快速获得目标化合物。该方法快速、精确、自动化程度高、适用性强，适合于结构特殊但丰度极低的天然产物的快速发现、目标导向分离。本专利技术包括以下内容：(1)介藜芦类异甾体生物碱的质谱表征：采用LC-QTOF-MS/MS联用技术对介藜芦类异甾体生物碱进行质谱表征，根据质谱裂解规律提出诊断离子。在液相色谱参数和其他质谱参数固定的前提下，在25～60V区间内，以5V为间隔对碰撞能量进行优化。通过比较不同介藜芦类异甾体生物碱对照品在不同碰撞能量下的裂解碎片和丰度变化，分子中不含糖的介藜芦类异甾体生物碱最佳碰撞能量为35～45V，此时前体母离子已经碎裂，特征子离子(如m/z 67.05，m/z 84.08，m/z 85.06，m/z 109.10，m/z 114.09)的丰度达到最大；同样地，含糖的介藜芦类异甾体生物碱最佳碰撞能量为45～55V；另外，随着碰撞能量的加大(50～60V或更大)，所有生物碱二级质谱的基峰均由m/z 109.10或m/z 114.09转移为m/z 67.05。综合以上信息，选择40V作为不含糖的介藜芦类异甾体生物碱的碰撞能量，50V作为含糖的介藜芦类异甾体生物碱的碰撞能量，在此电压下，m/z 67.05，m/z 84.08，m/z 109.10，m/z 114.09的离子丰度百分比均在20％以上，并且基峰离子是m/z 109.10或m/z 114.09，将这四种离子作为介藜芦类异甾体生物碱的诊断碎片离子。(2)贝母属植物中环巴胺类似物的化学筛选：采用LC-QQQ-MS/MS联用技术筛选贝母属植物中的环巴胺类似物。以5种介藜芦类异甾体生物碱混合对照品溶液在ESI正离子模式下进行裂解电压、碰撞能量的本文档来自技高网...

【技术保护点】
质谱导向分离贝母属植物中环巴胺类似物的方法，其特征在于：以介藜芦类异甾体生物碱对照品的共有产物离子为导向，通过引入LC‑QTOF‑MS/MS技术，建立了介藜芦类异甾体生物碱的快速表征方法，再借助LC‑QQQ‑MS/MS强大的筛选功能，从贝母属药材中筛选出了一系列环巴胺类似物，然后采用自动纯化系统根据馏分的质谱响应信号进行馏分的制备。

【技术特征摘要】
1.质谱导向分离贝母属植物中环巴胺类似物的方法，其特征在于：以介藜芦类异甾体生物碱对照品的共有产物离子为导向，通过引入LC-QTOF-MS/MS技术，建立了介藜芦类异甾体生物碱的快速表征方法，再借助LC-QQQ-MS/MS强大的筛选功能，从贝母属药材中筛选出了一系列环巴胺类似物，然后采用自动纯化系统根据馏分的质谱响应信号进行馏分的制备。2.根据权利要求1的质谱导向分离贝母属植物中环巴胺类似物的方法，其特征在于：介藜芦类异甾体生物碱的质谱表征：采用LC-QTOF-MS/MS联用技术对介藜芦类异甾体生物碱进行质谱表征，根据质谱裂解规律提出诊断离子；在液相色谱参数和其他质谱参数固定的前提下，在25～60V区间内，以5V为间隔对碰撞能量进行优化；通过比较不同介藜芦类异甾体生物碱对照品在不同碰撞能量下的裂解碎片和丰度变化，分子中不含糖的介藜芦类异甾体生物碱最佳碰撞能量为35～45V，此时前体母离子已经碎裂，特征子离子m/z 67.05，m/z 84.08，m/z 85.06，m/z 109.10，m/z 114.09的丰度达到最大；同样地，含糖的介藜芦类异甾体生物碱最佳碰撞能量为45～55V；另外，随着碰撞能量加大到50～60V，所有生物碱二级质谱的基峰均由m/z 109.10或m/z 114.09转移为m/z 67.05；综合以上信息，选择40V作为不含糖的介藜芦类异甾体生物碱的碰撞能量，50V作为含糖的介藜芦类异甾体生物碱的碰撞能量，在此电压下，m/z 67.05，m/z 84.08，m/z 109.10，m/z 114.09的离子丰度百分比均在20％以上，并且基峰离子是m/z 109.10或m/z 114.09，将这四种离子作为介藜芦类异甾体生物碱的诊断碎片离子；贝母属植物中环巴胺类似物的化学筛选：采用LC-QQQ-MS/MS联用技术筛选贝母属植物中的环巴胺类似物；以5种介藜芦类异甾体生物碱混合对照品溶液在ESI正离子模式下进行裂解电压、碰撞能量的优化；使用多反应监测模式，在100～180V区间内，以20V为间隔对裂解电压进行优化；使用子离子扫描模式，在40～60V区间内，以5V为间隔对碰撞能量进行优化；最终确定裂解电压为120V，碰撞能量为45V；并对母离子进行全扫描，确定5种介藜芦类异甾体生物碱的准分子离子分别为CA m/z 412.3、CS m/z 574.4、JV m/z 426.3、PJV m/z 588.4和PS m/z 428.3；然后以上述离子为母离子，对其子离子进行全扫描，测得主要的子离子均为m/z67.05、m/z 81.1、m/z 84.1、m/z 85.1、m/z 109.1和m/z 114.1，且这6个子离子的丰度均在20％以上，其中m/z 67.05、m/z 109.1和m/z 114.1的丰度在50％以上；在采用母离子扫描模式扫描母离子时，软件中设置的产物离子不能超过4个；以15种异甾体生物碱对照品为对象优化母离子扫描模式的参数，将丰度最高的m/z 67.05、m/z 109.1和m/z 114.1固定为产物离子，再从m/z 81.07、m/z 84.08和m/z 85.06...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜艳，李会军，杜园，
申请(专利权)人：南京林业大学，中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32