本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是鱼类brms1a和Ivns1a基因的应用。鱼类brms1a或Ivns1a基因用于制备抗细菌感染的制剂中的应用。所述表达鱼类brms1a和Ivns1a基因的质粒pCNbrms和pCNIvns在抗细菌感染中应用。本发明专利技术的鱼类brms1a和Ivns1a基因表达质粒注射鱼类后能够显著提高鱼类抵抗细菌感染的能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是鱼类brms1a和Ivns1a基因的应用。
技术介绍
Brms1a(breast cancer metastasis suppressor 1a)和Ivns1a(influenza virus NS1A binding protein a)是两个已被证明在哺乳动物中具有促凋亡作用的新颖基因。Brms1a属于一类肿瘤转移抑制基因，最早在乳腺癌中被发现。Brms1a可以通过抑制骨调素(osteopontin)的表达，从而促进细胞的凋亡，阻断多种癌细胞的转移。Ivns1a参与调节多个细胞功能，包括抑制核酸的转运，结合mRNA的poly(A)序列，抑制mRNA前体的剪切，以及诱导细胞的凋亡。目前关于Brms1a和Ivns1a的研究主要集中在哺乳动物中，其作用在鱼类中尚无报道。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供鱼类brms1a和Ivns1a基因的应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种鱼类的brms1a和Ivns1a基因的应用，鱼类brms1a或Ivns1a基因用于制备抗细菌感染的制剂中的应用。所述含鱼类brms1a或Ivns1a基因的表达质粒pCNbrms或pCNIvns在制备抗鱼类细菌感染制剂中的应用。所述含鱼类brms1a或Ivns1a基因的表达质粒pCNbrms或pCNIvns在制备抗迟缓爱德华氏菌感染制剂中的应用。所述鱼类brms1a或Ivns1a基因以半滑舌鳎cDNA为模板，分别用引物F1/R1或F2/R2进行PCR扩增，扩增产物分别与载体pCN3连接，即获得brms1a基因质粒pCNbrms或Ivns1a基因质粒pCNIvns；所述F1为5’-GATATCGCCACCATGCCAGTGCACTCGAGAGAA-3’；R1为5’-GATATCGGCATGTTTTACGGTGTATTTGC-3’；F2为5’-GATATCGCCACCATGATTCCCAACGGATATTTGAT-3’；R2为5’-GATATCTTGAGAAAAAACTCCAAACGCTA-3’。本专利技术具有如下优点：本专利技术的鱼类brms1a和Ivns1a基因表达质粒注射后能够显著提高鱼类的抗细菌能力。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而非以任何形式对本专利技术进行限制。在本专利技术实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。2.大肠杆菌用Hanahan方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)。3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。实施例1鱼类brms1a和Ivns1a基因表达质粒pCNbrms和pCNIvns的构建：鱼类brms1a和Ivns1a基因的序列已被报道(GenBank accession number：EU519228和DQ535486)。pCNbrms的构建如下：以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增brms1a基因。PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA,然后94℃ 40s,60℃ 60s,72℃ 60s,5个循环后改为94℃ 40s,64℃ 60s,72℃ 60s,30个循环。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2－4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5α后在含有100μg/ml安卡青霉素(Ap)、40μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷和24μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18－24小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒pBSbrms。将表达载体pCN3(构建过程参见Jiao XD,Zhang M,Hu YH,Sun L.Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda antigens.Vaccine2009；27:5195–202.)用限制性内切酶EcoRV酶切后回收5.4kb片段，同时将pBSbrms用EcoRV酶切回收brms1a片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2－4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在氨苄青霉素(100ug/ml)的LB培养基培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，命名为pCNbrms。通过DNA测序分析证明了pCNbrms为含有brms1a基因序列的表达质粒。pCNIvns的构建如下：以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F2和R2进行PCR扩增Ivns1a基因。PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA,然后94℃ 40s,57℃ 60s,72℃ 60s,5个循环后改为94℃ 40s,61℃60s,72℃ 60s,30个循环。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(同上)于室温连接2－4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5α后在含有100μg/ml安卡青霉素、40μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷和24μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18－24小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒pBSIvns1a。将表达载体pCN3(同上)用限制性内切酶EcoRV酶切后回收5.4kb片段，同时将pBSIvns1a用EcoRV酶 切回收Ivns1a片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2－4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，命名为pCNIvns。通过DNA测序分析证明了pCNIvns为含有Ivns1a基因序列的表达质粒。所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-GATATCGCCACCATGCCAGTGCACTCGAGAGAA-3’；R1为5’-GATATCGGCATGTTTTACGGTGTATTTGC-3’；F2为5’-GATATCGCCACCATGATTCCCAACGGATATTTGAT-3’；R2为5’-GATATCTTGAGAAAAAACTCCAAACGCTA-3’。实施例2鱼类brms1a和Ivns1a基因表达质粒pCNbrms和pCNIvns的应用步骤1)质粒注射将上述实施例1的pCNbrms和pCNIvns在PBS中稀释至100ug/ml，即为pCNbrms和pCNIvns稀释液。将30条斑马鱼(重约3.2g)随机分为3组，每组10条。将这3组分别命名为A，B和C。将A组的每条鱼分别注射100ul pCNbrms稀释液，将B组的每条鱼分别注射100ul pCNIvns稀释液，将C组(对照组)的每条鱼分别注射100ul PBS。所述PBS组成成分按重量本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鱼类的brms1a和Ivns1a基因的应用，其特征在于：鱼类brms1a或Ivns1a基因用于制备抗细菌感染的制剂中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种鱼类的brms1a和Ivns1a基因的应用，其特征在于：鱼类brms1a或Ivns1a基因用于制备抗细菌感染的制剂中的应用。2.按权利要求1所述的鱼类brms1a和Ivns1a基因的应用，其特征在于：所述含鱼类brms1a或Ivns1a基因的表达质粒pCNbrms或pCNIvns在制备鱼类抗细菌感染制剂中的应用。3.按权利要求2所述的鱼类brms1a和Ivns1a基因的应用，其特征在于：所述鱼类brms1a或Ivns1a基因以半滑舌鳎cDNA为模板，分别用引物F1/...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，周泽军，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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