一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法技术

一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，包括如下步骤：第1步，使用阳离子交换树脂对牛乳中的乳铁蛋白进行吸附、解附；第2步，对第1步得到的解附液进行浓缩；第3步，第2步得到的浓缩液采用不溶性Fe3+螯合树脂对Fe3+进行吸附，再对浓缩液进行浓缩。本方法能够降低乳铁蛋白中Fe3+离子含量，使铁饱和度降低至5‑8%，明显提高乳铁蛋白的抗菌活性和产品品质的标准化与一致性；通过调整Fe3+螯合树脂吸附的时间、搅拌速度以及媒介的浓度、pH，可以对乳铁蛋白中铁的饱和度进行控制，满足不同产品功能对乳铁蛋白饱和度的要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，属于蛋白提取与制备

技术介绍
乳铁蛋白具有抗微生物活性是由于它具有结合对于某些细菌生长必需的铁的能力。一些研究者（Bishop等，1977；Payne等，1990）的研究证实乳铁蛋白的抗微生物活性依赖于它的铁饱和度。Batish等人（1988）还发现低铁饱和度乳铁蛋白的抗菌活性比高铁饱和度乳铁蛋白的抗菌活性高。中国专利CN200510095244.3公开了一种从牛奶或者乳清水中提取与制备高纯度乳铁蛋白的方法，其中制备的乳铁蛋白纯度虽然较高，但是由于奶源的产地不同，比如奶牛的品种、饲养地以及所用饲料均存在一定的区别，因此导致牛奶中乳铁蛋白的铁饱和度具有较大的随机性，难以满足其标准化、规模化应用的需要。为拓宽乳铁蛋白应用，为了保证功效的一致性，需要乳铁蛋白保持稳定一致的饱和度；目前将铁饱和度保持一致的高饱和度可以通过加入铁离子的方式；但是在抗菌类药物的生产过程中为了保证功效的稳定性，需要乳铁蛋白保持稳定一致的低铁饱和度，从而实现药物的标准化、规模化生产；但是目前还未见将乳铁蛋白实现一致低铁饱和度的生产工艺，导致药物抗菌活性未能达到最佳效果；因此，如何实现乳铁蛋白低铁饱和度，满足其做为药品原料标准化的要求，即成为亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术涉及一种用阳离子交换树脂及不溶性Fe3+螯合树脂提取与制备与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，解决现有技术制备的乳铁蛋白铁饱和度较高且随机而影响抗菌性能的缺陷。技术方案是：一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，包括如下步骤：第1步，使用阳离子交换树脂对牛乳中的乳铁蛋白进行吸附、解附；第2步，对第1步得到的解附液进行浓缩；第3步，第2步得到的浓缩液采用不溶性Fe3+螯合树脂对Fe3+进行吸附，再对浓缩液进行浓缩。所述的第1步中，解附过程是采用二级解附，第一级解附是采用1～2.5%的盐溶液解附，解附液是乳过氧化物酶蛋白，另用；第二级解附是采用3.5～7%的盐溶液解附，解附液送入第2步处理。所述的盐溶液是指钠盐、钾盐或者钙盐溶液。所述的第2步中，采用分离膜对解附液进行浓缩；所述的分离膜是截留分子量在1000～50K的超滤膜。所述的第3步中，不溶性Fe3+螯合树脂是指D403螯合树脂等系列树脂。所述的第3步中，所述的第3步中，吸附操作时需要在浓缩液中加入醋酸、醋酸盐以及枸橼酸盐，配制其吸附环境中枸橼酸盐浓度为0.05mol/L~1.0mol/L，并调节pH至4.0～6.7；枸橼酸盐可以选择为枸橼酸钠;醋酸、醋酸盐建立缓冲体系，比如醋酸-醋酸钠缓冲液。所述的第3步中，树脂的吸附时间10～150分钟，吸附时搅拌桨转速速率为10～150rpm，吸附温度在3～30℃所述的第2步得到的浓缩液在送入第3步之前，需要再经过一次弱酸型阳离子树脂的吸附、解附和超滤膜的浓缩处理。所述的弱酸型阳离子树脂是指CM树脂等阳离子树脂。所述的第3步中，采用分离膜对浓缩液进行浓缩；所述的分离膜是截留分子量在1000～50K的超滤膜。所述第1步中，阳离子交换树脂的制备步骤为：第1步，取10g氯乙酰化聚苯乙烯-二乙烯基苯微球载体PS-acyl-Cl，加入60ml四氢呋喃溶胀12 h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比PS-acyl-Cl：乙二胺：碳酸氢钠为1：8：0.7，依次加入乙二胺和碳酸氢钠，在于80℃下搅拌反应24h，反应结束后，将产物倒入砂芯漏斗中，用蒸馏水洗至中性，甲醇洗滤3遍真空干燥至恒重，得到交联EDA微球载体；第2步，称60g取交联EDA微球载体，置于三颈烧瓶中，加入二甲基甲酰胺溶胀12 h后，加入2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸16g、N-丁氧基甲基丙烯酰胺3g、丙烯酸双环戊烯基酯、K2CO3 5g、四丁基溴化铵12g，搅拌下于一定温度的油浴中回流反应，反应结束后将反应产物转移至沙芯漏斗中，用5wt%的HC1清洗4遍后用蒸馏水滤洗至中性，最后用甲醇洗滤后抽干，真空干燥至恒重，得到阳离子交换树脂。所述牛乳可以是鲜牛乳、牛初乳、乳清或转基因牛乳。有益效果本专利技术提供的方法具有乳铁蛋白提取与制备纯度高的优点，同时能够降低乳铁蛋白中Fe3+离子含量，使铁饱和度降低至5-8%，从而明显提高了乳铁蛋白的抗菌活性。此外通过调整Fe3+螯合树脂吸附的时间、搅拌速度以及媒介的浓度、pH，可以对乳铁蛋白处理后的铁饱和度进行控制，以满足不同产品应用对乳铁蛋白铁饱和度的要求。具体实施方式本专利技术提供的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，它分别用放置阳离子交换树脂的搅拌罐来吸附、解附牛乳中乳铁蛋白，并辅以膜分离技术将其分离、浓缩，可以实现对乳铁蛋白的高度纯化；接下来，将所得乳铁蛋白浓缩液放置不溶性Fe3+螯合树脂（如D403螯合等系列树脂）的搅拌罐来吸附铁离子使其失去铁离子变为不饱和状态，并辅以膜分离将其浓缩纯化。在使用阳离子交换树脂对乳铁蛋白进行吸附、解吸时，搅拌罐可调搅拌桨转速速率为20～100rpm;罐内侧壁有增涡流挡板，罐底设置带过滤板的树脂床，在树脂床上的树脂层上方8～12cm高度处设置快速导流抽滤管。罐内设置供自动控制的各种传感器pH计，重量计，电导率计及温度计，罐内液体保温温度为3～60℃。乳铁蛋白吸附树脂为阳离子交换树脂，树脂吸附解附的次数和条件可以根据不同产品和产品纯度的要求设定；树脂的吸附时间为20～120分钟，吸附温度在3～30℃。树脂的解附采用两级盐浓度分别解附乳过氧化物酶蛋白、乳铁蛋白。第一级盐浓度为1～2.5%，解附乳过氧化物酶蛋白，解附时间为20～120分钟；第二级盐浓度为3.5～7%，解附乳铁蛋白，解附时间为20～120分钟；解附的搅拌速率为20～150rpm。树脂解附的时间为20～120分钟，树脂解附所用的盐为钠盐、钾盐、钙盐；乳铁蛋白解附液通过0.05～1.4微米的微滤膜将乳铁蛋白解附液除菌，去残余的脂肪与其他小颗粒；再用1K～50K分子截留量的超滤膜进行脱盐和浓缩。在一个实施方式中，为了提高乳铁蛋白的纯度，可以对经上述工艺吸附解附脱盐浓缩的乳铁蛋白浓液再经过一次弱酸型阳离子树脂（如CM树脂）的吸附、解附和超滤膜的浓缩获得的。上述得到的浓缩液再放置于不溶性Fe3+螯合树脂如D403螯合树脂，加入醋酸溶液、醋酸盐、枸橼酸盐作为媒介，配制其吸附环境浓度为0.05mol/L～1.0mol/L，调pH4.0～6.7，加以搅拌吸附乳铁蛋白中铁离子，树脂吸附搅拌时间、媒介浓度、转速、pH可根据产品对铁饱和度的要求设定（经实验测定，吸附时间对铁饱和度影响最大，拟取10～150分钟）；树脂的吸附时间10～150分钟，搅拌桨转速速率为10～150rpm，吸附温度在3～30℃。吸附后清液用1K-50K分子截留量的超滤膜进行脱盐和浓缩。将乳铁蛋白浓液进行真空冷冻干燥制成冻干粉。树脂经吸附工艺过程后，所吸附的铁离子用1mol/L～3mol/L盐酸浸泡即可将树脂解附再生，再用RO水冲洗即可供下一批次吸附之用。实施例1 阳离子交换树脂的制备本专利技术所使用的阳离子交换树脂可以通过如下的方法制备得到：第1步，取10g氯乙酰化聚苯乙烯-二乙烯基苯微球载体(PS-acyl-Cl)，加入60m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：第1步，使用阳离子交换树脂对牛乳中的乳铁蛋白进行吸附、解附；第2步，对第1步得到的解附液进行浓缩；第3步，第2步得到的浓缩液采用不溶性Fe3+螯合树脂进行吸附，再对浓缩液进行浓缩。

【技术特征摘要】
1.一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：第1步，使用阳离子交换树脂对牛乳中的乳铁蛋白进行吸附、解附；第2步，对第1步得到的解附液进行浓缩；第3步，第2步得到的浓缩液采用不溶性Fe3+螯合树脂进行吸附，再对浓缩液进行浓缩。2.根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述的第1步中，解附过程是采用二级解附，第一级解附是采用1～2.5%的盐溶液解附，解附液是乳过氧化物酶蛋白，另用；第二级解附是采用3.5～7%的盐溶液解附，解附液送入第2步处理；所述的盐溶液是指钠盐、钾盐或者钙盐溶液。3.根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述的第2步中，采用分离膜对解附液进行浓缩；所述的分离膜是截留分子量在1000～50K的超滤膜。4.根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述的第3步中，不溶性Fe3+螯合树脂是指D403螯合树脂。5.根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述的第3步中，吸附操作时需要在浓缩液中加入醋酸、醋酸盐以及枸橼酸盐，配制其吸附环境中枸橼酸盐浓度为0.1mol/L~1.0mol/L,并调节pH至4.0～6.7。6.根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述的第3步中，树脂的吸附时间10～150分钟，吸附时搅拌桨转速速率为10～150rpm，吸附温度在3～30℃。7.根据权利要求1所述的从牛...

【专利技术属性】
技术研发人员：方雅悯，陈新凯，方存林，
申请(专利权)人：方雅悯，方存林，
类型：发明
国别省市：浙江;33