本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种荧光淬灭法测定原花青素‑金属离子络合能力的方法，该方法利用金属离子对原花青素酚羟基的淬灭作用，将金属离子溶液逐步滴加至原花青素溶液中，记录原花青素的荧光强度衰变曲线，利用Stern‑Volmer荧光淬灭方程计算得到络合反应的结合常数，利用Job’s法测定络合物中金属离子与原花青素的化学计量比。本发明专利技术所述分析方法成本低廉，操作简单，检测时间短、准确性高，应用范围广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体的说是涉及一种荧光淬灭法测定原花青素-金属离子络合能力的方法。
技术介绍
原花青素(proanthocyanidin,PC)也称缩合单宁，是广泛存在于植物体内具有多种生理活性的黄烷醇类多元酚化合物。原花青素是指从植物中分离得到的，在酸性热醇处理下能产生花色素(anthocyanidin)的多酚类物质，包括单宁和聚合体。单体原花青素包括黄烷-4-醇和黄烷-3,4-二醇，聚合体原花青素有低聚和高聚两种类型。原花青素聚合体是由黄烷-3-醇的单体结构单宁(儿茶素、表儿茶素)聚合而成的高分子聚合物，其键合(或氧化缩合)位置常发生在杂环C4和A环的C6或C8位置，其中以直连4→8键聚合的原花青素最为常见。作为酚类物质的一种，原花青素具有和金属离子络合的共性。然而和其它小分子酚类化合物相比，原花青素与金属离子的配位络合能力要高出很多，其与金属离子的配位络合能力比小分子的苯酚及邻苯二酚要高出几个数量级。原花青素与金属离子的配位络合能力与原花青素的分子量有一定的关系，当原花青素经过磺化处理后，由于大分子被降解，分子量变小，与金属离子配位时的位阻减小，同时C环被打开，使原花青素与金属离子络合能力提高的更多。原花青素主要是通过其组成结构单元(如儿茶素、表儿茶素)上的酚羟基团与金属离子发生配位反应。相比与小分子的酚酸化合物，原花青素与金属离子的配位络合反应更为复杂，由于分子间相互作用力的存在及空间构型的原因，原花青素不同组成单元之间对金属离子的配位络合能力并不相同。目前尚未见到对原花青素与金属离子配位络合反应的定量关系研究的报道。尚缺乏从该反应的化学计量学或反应平衡常数等纯化学角度关于原花青素与金属离子相互反应的定量关系研究。了解原花青素与金属离子的配位反应的定量关系在许多研究领域具有重要的意义。由于原花青素分子结构中具有邻苯二酚结构，使其能够与金属离子(尤其是过渡金属元素)通过配位反应形成络合物。原花青素与金属离子的相互作用不仅影响植物的营养和毒素作用，还影响生态环境中其它代谢过程，如腐殖质的形成。人体中许多生化反应过程均需要金属离子的参与。有机体内的过渡金属离子是氧自由基产生的“罪魁祸首”。铁离子在有机体内存在亚铁离子(Fe2+)和铁离子(Fe3+)两种明显不同的氧化状态。Fe3+是一种生物活性相对不活泼的铁离子形式。但是在一定的条件下，特别是在特定的pH下它能够被还原成生物活性较活泼的Fe2+形式，并可通过芬顿反应(Fenton-type reactions)被氧化回Fe3+形式，并产生羟基自由基；或者发生Haber-Weiss循环反应产生超氧阴离子。所产生的这些自由基能够导致机体发生脂质过氧化反应、蛋白质的改性及DNA的损伤。原花青素能够通过与金属离子发生配位络合形成原花青素-金属离子络合物使金属离子失去活性，从而阻止了金属离子催化的相关生化反应的发生。原花青素与金属离子的配位络合反应特性还是制备金属离子富集和脱除材料的基础，利用原花青素吸附金属离子的特性，可以将原花青素作为金属离子的富集和脱除材料。
技术实现思路
本专利技术目的是针对目前对原花青素络合金属离子定量分析检测方法的空白，提供一种操作简单、耗时短、准确度高、选择性强的原花青素络合金属离子定量分析检测方法。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种荧光淬灭法测定原花青素-金属离子络合能力的方法，在pH 4-9的醋酸盐缓冲液中加入原花青素溶液，用金属离子溶液进行荧光淬灭滴定实验，根据反应溶液荧光强度的衰变曲线，利用Stern-Volmer荧光淬灭方程计算得到原花青素与金属离子络合反应的结合常数；利用等摩尔连续变化法测定金属离子与原花青素的络合比例。所述的原花青素溶液为0.05-1.0mM原花青素甲醇-水溶液，甲醇和水的体积比为1:1。金属离子溶液的浓度为0.05-1.0mM。荧光淬灭实验中以280nm为激发波长λex，在荧光光谱仪上记录290-500nm波长范围内的发射光谱。所述的络合反应的结合常数Ksv的计算是在320nm波长下，将反应溶液相对荧光强度变化值F0/F对加入的金属离子含量作图，得到金属离子对原花青素的荧光淬灭Stern-Volmer曲线，由淬灭曲线求得不同金属离子与原花青素的络合物的络合常数Ksv。所述的金属离子包括Sn2+,Zn2+,Cu2+,Al3+。所述缓冲液pH 6.0为最佳反应条件。有益效果：本专利技术利用金属离子对原花青素结构单元上酚羟基的荧光淬灭作用来定量分析原花青素与不同金属离子的络合能力。原花青素与金属离子的络合反应受反应液pH值影响较大，经条件优化得到pH 6为最佳反应条件，在此pH值下原花青素与金属离子络合能力最强。在pH 6的缓冲液中加入原花青素溶液，用金属离子溶液进行荧光淬灭滴定实验，根据反应溶液荧光强度的衰变曲线，利用Stern-Volmer荧光淬灭方程计算得到原花青素与金属离子络合反应的结合常数；利用Job’s法测定金属离子与原花青素的络合比例。本专利技术方法使用鉴定的荧光检测仪器检测荧光，不需要使用昂贵的大型分析仪器，检测性能优异，检测时间短、灵敏度高，是一种简便、快速、成本低、应用范围广的定量分析原花青素(缩合单宁)络合金属离子能力的分析方法。附图说明图1为不同浓度Sn2+和Al3+对高粱原花青素(PC)的荧光淬灭图谱λex,280nm；c(PC),1.67μM；c(Sn2+)(a→k),0.0,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.3,0.35,0.4,0.45,0.5μM.；其中A图为Sn2+、B图为Al3+的图谱。图2 Sn2+和Al3+对高粱原花青素(PC)的荧光淬灭Stern-Volmer曲线图，c(PC),1.67μM。图3示Sn2+,Zn2+,Cu2+,Al3+分别与高粱原花青素(PC)络合物化学计量比测定(Job’s法)。具体实施方式本专利技术实施例公开了一种荧光淬灭法测定原花青素络合金属离子的定量分析方法。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种荧光淬灭滴定技术对原花青素络合金属离子的定量分析方法，1.荧光光谱的测定：移取2900-2990μL醋酸盐缓冲溶液(pH 6)于1cm石英池中，加入10-100μL浓度范围为0.05-1.0mM原花青素甲醇-水(体积比1:1)溶液，充分混匀后用可调式移液器逐次加入浓度范围为0.05-1.0mM金属离子0.1M盐酸溶液进行滴定反应，每次加入后混合均匀，以280nm为激发波长(λex)，在荧光分光光度计上记录290-500nm波长范围内的发射光谱。2.络合反应的结合稳定常数(Ksv)计算：在320nm波长下，将反应液相对荧光强度变化值(F0/F)对金属离子浓度作图，可得到金属离子对原花青素的荧光淬灭Stern-Volmer曲线，由淬灭曲线求得不同金属离子与原花青素的络合物的络合稳定常数(Ksv)。3.络合物组成比例测定：利用等摩尔连续变化法(又称Job’s法)测定络合物中金属离子与原花青素的化学计量比。所述缓冲液pH为4-9，经过优化最终选择pH 6为最佳反应条件。实验仪器：Hitachi 850型荧光分光光度计(日本日立公司)荧光光谱的测定：移取2900μL醋酸盐缓冲溶液(pH 6)于1cm石英池中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光淬灭法测定原花青素‑金属离子络合能力的方法，其特征在于，在pH 4‑9的醋酸盐缓冲液中加入原花青素溶液，用金属离子溶液进行荧光淬灭滴定实验，根据反应溶液荧光强度的衰变曲线，利用Stern‑Volmer荧光淬灭方程计算得到原花青素与金属离子络合反应的结合常数；利用等摩尔连续变化法测定金属离子与原花青素的络合比例。
【技术特征摘要】
1.一种荧光淬灭法测定原花青素-金属离子络合能力的方法，其特征在于，在pH 4-9的醋酸盐缓冲液中加入原花青素溶液，用金属离子溶液进行荧光淬灭滴定实验，根据反应溶液荧光强度的衰变曲线，利用Stern-Volmer荧光淬灭方程计算得到原花青素与金属离子络合反应的结合常数；利用等摩尔连续变化法测定金属离子与原花青素的络合比例。2.根据权利要求1所述的荧光淬灭法测定原花青素-金属离子络合能力的方法，其特征在于，所述的原花青素溶液为0.05-1.0mM原花青素甲醇-水溶液，甲醇和水的体积比为1:1。3.根据权利要求1所述的荧光淬灭法测定原花青素-金属离子络合能力的方法，其特征在于，金属离子溶液的浓度为0.05-1.0mM。4.根据权利要求1所述的荧光淬灭法测定原花青素-金属离子络合能力的方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：张亮亮，汪咏梅，徐曼，胡新宇，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林产化学工业研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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