【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物工程，更具体地说，涉及一种基于重组大肠杆菌pet-podorha-de3高产α-鼠李糖苷酶或异槲皮素的方法。
技术介绍
1、α-鼠李糖苷酶是一种特异性水解末端鼠李糖基的糖苷水解酶，在天然产物转化方面具有广泛的应用，可将人参皂苷、柴胡皂苷c和薯蓣皂苷等常见皂苷类化合物以及芦丁、橘皮苷和朝藿定c等黄酮糖苷类化合物转化为生物活性更强的天然药物。α-鼠李糖苷酶在自然界中来源广泛，在细菌、真菌和植物体中均有发现。而微生物中的天然α-鼠李糖苷酶含量较低，通过提取分离获得鼠李糖苷酶往往存在使用成本高的问题。除此之外，微生物分泌的酶种类较多，提取获得的鼠李糖苷酶纯度难以保证，用于生物转化时副产物较多，纯化后才能获得高纯度的鼠李糖苷酶。通过基因工程构建产α-鼠李糖苷酶的重组菌，高效表达重组α-鼠李糖苷酶podorha，通过简便的亲和层析等纯化方式获得高纯度α-鼠李糖苷酶，并用于天然产物或药物中间体的转化是目前较为常见的生物转化路径。在这一过程中酶蛋白的产量是生物转化效率和成本的关键影响因素，除了通过诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间等因素对目的基因的翻译和转录水平进行调控外，以小分子激活剂对宿主菌产酶效率进行调节同样能够提高重组蛋白的产量。
2、另一方面，相比于酶介导的生物转化过程，以含有重组酶的宿主菌，如重组大肠杆菌，进行全细胞生物转化不仅减少了重组酶分离纯化的成本，而且宿主微生物可回收使用，进一步降低了生物转化的成本，具有极高的应用前景。一般情况下，以大肠杆菌为宿主菌生产的重组酶多为胞内酶，而黄酮糖苷类天然药物的对
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种基于重组大肠杆菌pet-podorha-de3高产α-鼠李糖苷酶或异槲皮素的方法，用于激活重组大肠杆菌pet-podorha-de3生产α-鼠李糖苷酶，促进重组大肠杆菌pet-podorha-de3全细胞转化芦丁制备异槲皮素。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、一种基于重组大肠杆菌pet-podorha-de3高产α-鼠李糖苷酶的方法，包括：
4、将原始重组大肠杆菌pet-podorha-de3发酵液接种至添加激活剂的专用培养基tb-ba中，培养结束后收集发酵液，即得到高产α-鼠李糖苷酶的重组大肠杆菌pet-podorha-de3发酵液。
5、所述原始重组大肠杆菌pet-podorha-de3发酵液的制备方法为挑取原始重组大肠杆菌pet-podorha-de3单菌落接种至含有100ug/ml氨苄青霉素的30ml lb培养基中，于30℃下180转/min条件下过夜培养12h，制备得到原始重组大肠杆菌pet-podorha-de3发酵液。
6、所述激活剂为终浓度为0.5-25g/l的甜菜碱。
7、所述专用培养基tb-ba的配制方法为配制质量浓度为500g/l的甜菜碱水溶液，以0.22um滤膜过滤除菌后作为激活剂储存液；将激活剂储存液与灭菌后的2×tb培养基以体积比0.2-10％的比例混匀，并添加灭菌双蒸水至甜菜碱终浓度为0.5-25g/l，制备得到专用培养基tb-ba。
8、基于重组大肠杆菌pet-podorha-de3高产α-鼠李糖苷酶的方法，具体步骤包括：
9、1)挑取原始重组大肠杆菌pet-podorha-de3单菌落接种至含有100ug/ml氨苄青霉素的30ml lb培养基中，于30℃下180转/min条件下过夜培养12h，制备得到原始重组大肠杆菌pet-podorha-de3发酵液；
10、2)将原始重组大肠杆菌pet-podorha-de3发酵液接种至添加终浓度为0.5-25g/l的甜菜碱激活剂的专用培养基tb-ba中，于37℃下180转/min培养8h至od600值为9-11时，加入诱导剂iptg至终浓度为0.1mm；将培养瓶置于恒温振荡培养箱中在30℃下180转/min继续培养18h后收集发酵液，即得到高产α-鼠李糖苷酶的重组大肠杆菌pet-podorha-de3发酵液。
11、一种基于重组大肠杆菌pet-podorha-de3高产异槲皮素的方法，包括：
12、将原始重组大肠杆菌pet-podorha-de3发酵液离心得到沉淀菌体，向沉淀菌体中加入添加促进剂的全细胞转化专用培养基，获得全细胞转化系统，即为高产异槲皮素的重组大肠杆菌pet-podorha-de3。
13、所述全细胞转化系统的制备方法为将激活后的重组大肠杆菌pet-podorha-de3发酵液于4℃下10000×g离心20min后，去除旧tb-ba培养基，得到沉淀菌体；向沉淀菌体中加入全细胞转化专用培养基tb-ba-tm至菌体悬浊液中菌体含量至24-26g/l，获得全细胞转化系统。
14、所述全细胞转化专用培养基tb-batm的制备方法为将激活剂储存液和异丙醇分别以体积比2％的添加比例和质量体积比0.2-20％的添加比例与灭菌后的2×tb培养基混匀，加入灭菌双蒸水至激活剂终浓度为0.5-25g/l，异丙醇终浓度为1-100g/l，制得全细胞转化专用培养基tb-ba-tm。
15、所述促进剂为终浓度为1-100g/l的异丙醇。
16、基于重组大肠杆菌pet-podorha-de3高产异槲皮素的方法，具体步骤包括：
17、1)挑取原始重组大肠杆菌pet-podorha-de3单菌落接种至含有100ug/ml氨苄青霉素的30ml lb培养基中，于30℃下180转/min条件下过夜培养12h，制备得到原始重组大肠杆菌pet-podorha-de3发酵液；
18、2)将原始重组大肠杆菌pet-podorha-de3发酵液接种至添加终浓度为5g/l的甜菜碱激活剂的专用培养基tb-ba中，于37℃下180转/min培养8h至od600值为9-11时，加入诱导剂iptg至终浓度为0.1mm；将培养瓶置于恒温振荡培养箱中在30℃下180转/min继续培养18h后收集发酵液，即得到高产α-鼠李糖苷酶的激活后重组大肠杆菌pet-podorha-de3发酵液。
19、3)将激活后的重组大肠杆菌pet-podorha-de3发酵液于4℃下10000×g离心20min后，去除旧tb-ba培养基，得到沉淀菌体；向沉淀菌体中加入全细胞转化专用培养基tb-ba-tm至菌体悬浊液中菌体含量至24-26g/l，获得全细胞转化系统，即为高产异槲皮素的重组大肠杆菌pet-podorha-de3。
20、相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
21、1、本专利技术公开的激活剂甜菜碱，显著提高了重组大肠杆菌pe本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于重组大肠杆菌PET-podoRha-DE3高产α-鼠李糖苷酶的方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于重组大肠杆菌PET-podoRha-DE3高产α-鼠李糖苷酶的方法，其特征在于，所述原始重组大肠杆菌pET-podoRha-DE3发酵液的制备方法为挑取原始重组大肠杆菌pET-podoRha-DE3单菌落接种至含有100ug/mL氨苄青霉素的30mL LB培养基中，于30℃下180转/min条件下过夜培养12h，制备得到原始重组大肠杆菌pET-podoRha-DE3发酵液。
3.根据权利要求1所述的基于重组大肠杆菌PET-podoRha-DE3高产α-鼠李糖苷酶的方法，其特征在于，所述激活剂为终浓度为0.5-25g/L的甜菜碱。
4.根据权利要求1所述的基于重组大肠杆菌PET-podoRha-DE3高产α-鼠李糖苷酶的方法，其特征在于，所述专用培养基TB-Ba的配制方法为配制质量浓度为500g/L的甜菜碱水溶液，以0.22um滤膜过滤除菌后作为激活剂储存液；将激活剂储存液与灭菌后的2×TB培养基以体积比0.2-10％的
5.根据权利要求1-4任一所述的基于重组大肠杆菌PET-podoRha-DE3高产α-鼠李糖苷酶的方法，其特征在于，具体步骤包括：
6.一种基于重组大肠杆菌PET-podoRha-DE3高产异槲皮素的方法，其特征在于，包括：
7.根据权利要求6所述的基于重组大肠杆菌PET-podoRha-DE3高产异槲皮素的方法，其特征在于，所述全细胞转化系统的制备方法为将激活后的重组大肠杆菌pET-podoRha-DE3发酵液于4℃下10000×g离心20min后，去除旧TB-Ba培养基，得到沉淀菌体；向沉淀菌体中加入全细胞转化专用培养基TB-Ba-Tm至菌体悬浊液中菌体含量至24-26g/L，获得全细胞转化系统。
8.根据权利要求6所述的基于重组大肠杆菌PET-podoRha-DE3高产异槲皮素的方法，其特征在于，所述全细胞转化专用培养基TB-BaTm的制备方法为将激活剂储存液和异丙醇分别以体积比2％的添加比例和质量体积比0.2-20％的添加比例与灭菌后的2×TB培养基混匀，加入灭菌双蒸水至激活剂终浓度为0.5-25g/L，异丙醇终浓度为1-100g/L，制得全细胞转化专用培养基TB-Ba-Tm。
9.根据权利要求6所述的基于重组大肠杆菌PET-podoRha-DE3高产异槲皮素的方法，其特征在于，所述促进剂为终浓度为1-100g/L的异丙醇。
10.根据权利要求6-9任一所述的基于重组大肠杆菌PET-podoRha-DE3高产异槲皮素的方法，其特征在于，具体步骤包括：
...【技术特征摘要】
1.一种基于重组大肠杆菌pet-podorha-de3高产α-鼠李糖苷酶的方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于重组大肠杆菌pet-podorha-de3高产α-鼠李糖苷酶的方法，其特征在于，所述原始重组大肠杆菌pet-podorha-de3发酵液的制备方法为挑取原始重组大肠杆菌pet-podorha-de3单菌落接种至含有100ug/ml氨苄青霉素的30ml lb培养基中，于30℃下180转/min条件下过夜培养12h，制备得到原始重组大肠杆菌pet-podorha-de3发酵液。
3.根据权利要求1所述的基于重组大肠杆菌pet-podorha-de3高产α-鼠李糖苷酶的方法，其特征在于，所述激活剂为终浓度为0.5-25g/l的甜菜碱。
4.根据权利要求1所述的基于重组大肠杆菌pet-podorha-de3高产α-鼠李糖苷酶的方法，其特征在于，所述专用培养基tb-ba的配制方法为配制质量浓度为500g/l的甜菜碱水溶液，以0.22um滤膜过滤除菌后作为激活剂储存液；将激活剂储存液与灭菌后的2×tb培养基以体积比0.2-10％的比例混匀，并添加灭菌双蒸水至甜菜碱终浓度为0.5-25g/l，制备得到专用培养基tb-ba。
5.根据权利要求1-4任一所述的基于重组大肠杆菌pet-podorha-de3高产α-鼠李糖苷酶的方法，其特征在于，具体...
【专利技术属性】
技术研发人员：解静聪，蒋剑春，赵剑，陶冉，徐浩，杨静，张宁，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林产化学工业研究所，
类型：发明
国别省市：
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