一种用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的纳米结构微流控芯片及其制备方法，属于生物检测技术领域。本发明专利技术设计了两种纳米结构，硅纳米线阵列和SiO2及TiO2反蛋白结构的光子晶体，纳米结构具有粗糙的表面形貌，尺寸上能与循环肿瘤细胞表面结构有效接触，对循环肿瘤细胞进行倒置捕获。在芯片的组装过程采用简易的胶水封装，使得芯片的制作过程更加简单易行。此外，结合纳米磁性复合材料的光动力治疗作用，在芯片内实现循环肿瘤细胞的原位治疗，为了进一步实用化，我们设计并在芯片内嵌入光纤，导入激光，方便的实现芯片内循环肿瘤细胞的原位治疗。最后，我们还进一步提出微流控芯片可植入的开放设想。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种用于循环肿瘤细胞(循环肿瘤细胞是脱离原发肿瘤部位的癌细胞，作为一种癌症监测的标志物)捕获及治疗的纳米结构微流控芯片及其制备方法。
技术介绍
癌症作为人类致死的重大疾病，之所以死亡率如此地高以及难以治愈，主要是在于癌症发现晚及扩散。早期诊断和对癌细胞扩散的抑制乃至治疗对改善癌症治疗现状有着重要意义。癌症患者血液外周血中循环肿瘤细胞的数量极少，循环肿瘤细胞的数目为1～10个/mL，故从几百万的白细胞和数十亿的红细胞中有效地分选富集并将稀少的循环肿瘤细胞捕获成为一个难题。早期应用免疫磁珠富集技术，分离循环肿瘤细胞[1]，然而这种方法的检测灵敏度不足，技术成本高；之后开始利用细胞的物理特性进行分离[2]，例如循环肿瘤细胞相比较血液中的白细胞和红细胞尺寸存在差异，制备一定尺寸的过滤膜，对细胞流体进行过滤，从而分离循环肿瘤细胞，这种方法的特异性不足。2007年通过光刻蚀得到微柱[3]，并结合微流控芯片对循环肿瘤细胞进行捕获，微流控芯片被开始应用于解决循环肿瘤细胞捕获的问题。2009年提出应用化学法刻蚀制备了硅纳米线阵列[4]，由于纳米结构增加了与细胞接触的表面积，并且增加了表面粗糙度，与细胞的伪足绒毛等表面结构的尺寸相当，依靠细胞与纳米结构界面之间的接触可以实现对细胞的捕获，化学法刻蚀形成的纳米结构相比较光刻蚀制备的纳米微柱微结构，尺寸上更小，表面形貌更为丰富，制备工艺及成本也更加有优势，成为微流控芯片微结构设计的新形势。然而现存方法对循环肿瘤细胞的捕获效率及捕获纯度与临床应用需求仍然存在很大差距，由于抗原抗体的相互反应需要充分接触及反应时间，微流控芯片不能实现快速的检测，而且捕获效率和捕获纯度仍然有限。
技术实现思路
本专利技术为了改善目前微流控芯片存在的问题，结合已有的循环肿瘤细胞捕获方法，将化学法制备的纳米结构作为细胞捕获结构，与玻璃片或PDMS基底通
过封装胶水组装成简易微流控芯片，进一步利用表面修饰抗体的纳米磁性复合材料首先与循环肿瘤细胞特异性结合，再通过设有外磁场的微流控芯片体系，从细胞悬液或全血中依靠磁力的物理作用进行分离，进一步到达置于上层的纳米结构层，纳米结构具有粗糙的表面形貌，尺寸上能与细胞表面结构有效接触，对细胞进行倒置捕获。本专利技术设计了两种纳米结构：硅纳米线阵列和SiO2及TiO2反蛋白结构的光子晶体；在芯片的组装过程采用简易的胶水封装，使得芯片的制作过程更加简单易行。此外，结合纳米磁性复合材料的光动力治疗作用，在芯片内实现循环肿瘤细胞的原位治疗，为了进一步实用化，我们设计并在芯片内嵌入光纤，导入激光，方便的实现芯片内循环肿瘤细胞的原位治疗。最后，我们还进一步提出微流控芯片可植入的开放设想。一种用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片及其制备方法，(1)纳米结构的制备硅纳米线阵列的制备：将硅片超声清洗10～30min，再用去离子水冲洗后放入浓硫酸和过氧化氢组成的piranha溶液(食人鱼溶液)中浸泡2～12h，取出的硅片用去离子水冲洗后，放入硝酸银和氢氟酸组成的刻蚀溶液中避光反应1～3h；然后再将刻蚀后的硅片放入体积分数为15～30％的硝酸水溶液中浸洗1～2h，从而在硅片表面得到垂直于硅片表面生长的硅纳米线阵列，硅纳米线的直径为50～100nm，长度5～50μm，单位面积内纳米线的密度是30～40个/μm2。反蛋白石结构光子晶体的制备：将20mL～30mL MMA(甲基丙烯酸甲酯)用100～200mL、浓度为0.03～0.04mol/L的氢氧化钠水溶液清洗3～4遍，将2～5mL清洗过的MMA和30～50mL的去离子水混合后加热，在80～90℃条件下加入10～20mg的K2S2O8反应60～100min，得到单分散的PMMA纳米球溶液，PMMA纳米球的尺寸为200～600nm；将干净的载玻片垂直插入单分散的PMMA纳米球液体中，在30～40℃条件下保持20～24h，烘干，再在100～120℃条件下烘40～60min(强化结构)，从而在载玻片表面上得到PMMA蛋白石结构；该蛋白石结构为紧密排列的球阵列，厚度为130～900nm(可以为多层球阵列)，球心间距为200～600nm；将SiO2或TiO2前驱体溶液(TiO2前驱体溶液是由化学纯钛酸丁酯8～12mL、无水乙醇8～12mL、质量分数65％～68％硝酸水溶液0.5～2mL混合后配制而成；SiO2前驱体溶液由质量分数25～30％的硅酸乙酯3～4mL、无水乙醇8～12mL和质量分数30～40％的盐酸水溶液0.01～0.05mL混合后配制而成)逐滴滴到PMMA蛋白石结构表面(其自行慢慢渗入)，然后在450～550℃进行热处理2～4h，在载玻片表面得到380～980nm光子带隙的反蛋白石结构光
子晶体，为规则的反蛋白石结构，反蛋白石结构为原PMMA球紧密堆积的蛋白石结构在渗入TiO2或SiO2前驱体溶液后，经热处理后PMMA纳米球被去除，剩下围绕球堆积轮廓的TiO2或SiO2的结构，反蛋白石结构的孔中心之间的距离为130～420nm。(2)对所得的纳米结构进行抗体修饰(采用传统的巯基-马来酰亚胺基团硅烷化偶联法)：将硅纳米线阵列或反蛋白石结构光子晶体依次放入体积分数为4％的MPTS溶液(3-巯基丙基三甲氧基硅烷MPTS的乙醇溶液)、1μM的GMBS溶液(N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺GMBS的二甲基亚砜溶液)、10μg/mL链和亲霉素的磷酸缓冲盐溶液(pH＝7.2～7.4)、10μg/mL生物素化的EpCAM抗体(北京博奥森生物技术有限公司，Cat.Number:bs-0593R-bio)的磷酸缓冲盐溶液，反应时间分别为30～60min，从而获得修饰抗体的纳米结构基板；(3)芯片封装：将步骤(2)制备的修饰抗体的纳米结构基板和载玻片或嵌入光纤的PDMS(聚二甲基硅氧烷)之间用多层封口膜(美国Parafilm实验室封口膜)进行隔离，使用封口膜形成的芯片高度(即多层封口膜的厚度)为120μm～1mm；然后用胶水将基板和载玻片或嵌入光纤的PDMS的较长一侧封装，待胶水完全固化、芯片结构固定后取出封口膜(从而在基板和载玻片或嵌入光纤的PDMS之间留有空隙)，再用胶带将进样管和出样管分别粘贴在基板和载玻片或嵌入光纤的PDMS的较短一侧，并用胶水将整个芯片进行封装，从而制备得到一种用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片。进一步地，步骤(1)中所述的硅片为P型单面抛光硅片，电阻率为5～10Ω.cm，晶向[100]，厚度为360～400μm；进一步地，步骤(1)中所述的piranha溶液中浓硫酸溶液和双氧水溶液的体积比为3～7：1，浓硫酸溶液和双氧水溶液的质量分数分别为95～98％和20～40％。进一步地，步骤(1)中所述的刻蚀溶液中，HF水溶液的浓度为4.4～4.6mol/L，AgNO3水溶液的浓度为0.01～0.02mol/L，两者的用量体积比为1：4。进一步地，步骤(3)中所述的嵌入光纤的PDMS的制备：将聚二甲基硅氧烷PDMS与固化剂以质量比5：1的比例混合均匀后倒入方形模具，将1～10根光纤嵌入PDMS中，80～90℃固化1～3h；PDMS的厚度为1～5mm，光本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片的制备方法，其步骤如下：(1)纳米结构的制备硅纳米线阵列的制备：将硅片超声清洗10～30min，再用去离子水冲洗后放入浓硫酸和过氧化氢组成的piranha溶液中浸泡2～12h，取出的硅片用去离子水冲洗后，放入硝酸银和氢氟酸组成的刻蚀溶液中避光反应1～3h；然后再将刻蚀后的硅片放入体积分数为15～30％的硝酸水溶液中浸洗1～2h，从而在硅片表面得到垂直于硅片表面生长的硅纳米线阵列，硅纳米线的直径为50～100nm，长度5～50μm，单位面积内纳米线的密度是30～40个/μm2；反蛋白石结构光子晶体的制备：将20～30ml MMA用100～200ml、浓度为0.03～0.04mol/L的氢氧化钠水溶液清洗3～4遍，将2～5ml清洗过的MMA和30～50ml去离子水混合后加热，在80～90℃条件下加入10～20mg的K2S2O8反应60～100min，得到单分散的PMMA纳米球溶液，PMMA纳米球的尺寸为200～600nm；将干净的载玻片垂直插入单分散的PMMA纳米球液体中，在30～40℃条件下保持20～24h，烘干，再在100～120℃条件下烘40～60min，从而在载玻片表面上得到PMMA蛋白石结构；该蛋白石结构为紧密排列的球阵列，厚度为130～900nm，球心间距为200～600nm；将SiO2或TiO2前驱体溶液逐滴滴到PMMA蛋白石结构表面，然后在450～550℃进行热处理2～4h，在载玻片表面得到380～980nm光子带隙的反蛋白石结构光子晶体，为规则的反蛋白石结构，反蛋白石结构为原PMMA球紧密堆积的蛋白石结构在渗入TiO2或SiO2前驱体溶液后，经热处理后PMMA纳米球被去除，剩下围绕球堆积轮廓的TiO2或SiO2的结构，反蛋白石结构的孔中心之间的距离为130～420nm；(2)对所得的纳米结构进行抗体修饰：将硅纳米线阵列或反蛋白石结构光子晶体依次放入体积分数为4％的MPTS溶液、1μM的GMBS溶液、10μg/mL链和亲霉素的磷酸缓冲盐溶液、10μg/mL生物素化的EpCAM抗体的磷酸缓冲盐溶液，反应时间分别为30～60min，从而获得修饰抗体的纳米结构基板；(3)芯片封装：将步骤(2)制备的修饰抗体的纳米结构基板和载玻片或嵌入光纤的PDMS之间用多层封口膜进行隔离，使用封口膜形成的芯片高度为120μm～1mm；然后用胶水将基板和载玻片或嵌入光纤的PDMS的较长边一侧封装，待胶水完全固化、芯片结构固定后取出封口膜，再用胶带将进样管和出样管分别粘贴在基板和载玻片或嵌入光纤的PDMS的较短边一侧，并用胶水将整个芯片进行封装，从而制备得到用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片。...
【技术特征摘要】
1.一种用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片的制备方法，其步骤如下：(1)纳米结构的制备硅纳米线阵列的制备：将硅片超声清洗10～30min，再用去离子水冲洗后放入浓硫酸和过氧化氢组成的piranha溶液中浸泡2～12h，取出的硅片用去离子水冲洗后，放入硝酸银和氢氟酸组成的刻蚀溶液中避光反应1～3h；然后再将刻蚀后的硅片放入体积分数为15～30％的硝酸水溶液中浸洗1～2h，从而在硅片表面得到垂直于硅片表面生长的硅纳米线阵列，硅纳米线的直径为50～100nm，长度5～50μm，单位面积内纳米线的密度是30～40个/μm2；反蛋白石结构光子晶体的制备：将20～30ml MMA用100～200ml、浓度为0.03～0.04mol/L的氢氧化钠水溶液清洗3～4遍，将2～5ml清洗过的MMA和30～50ml去离子水混合后加热，在80～90℃条件下加入10～20mg的K2S2O8反应60～100min，得到单分散的PMMA纳米球溶液，PMMA纳米球的尺寸为200～600nm；将干净的载玻片垂直插入单分散的PMMA纳米球液体中，在30～40℃条件下保持20～24h，烘干，再在100～120℃条件下烘40～60min，从而在载玻片表面上得到PMMA蛋白石结构；该蛋白石结构为紧密排列的球阵列，厚度为130～900nm，球心间距为200～600nm；将SiO2或TiO2前驱体溶液逐滴滴到PMMA蛋白石结构表面，然后在450～550℃进行热处理2～4h，在载玻片表面得到380～980nm光子带隙的反蛋白石结构光子晶体，为规则的反蛋白石结构，反蛋白石结构为原PMMA球紧密堆积的蛋白石结构在渗入TiO2或SiO2前驱体溶液后，经热处理后PMMA纳米球被去除，剩下围绕球堆积轮廓的TiO2或SiO2的结构，反蛋白石结构的孔中心之间的距离为130～420nm；(2)对所得的纳米结构进行抗体修饰：将硅纳米线阵列或反蛋白石结构光子晶体依次放入体积分数为4％的MPTS溶液、1μM的GMBS溶液、10μg/mL链和亲霉素的磷酸缓冲盐溶液、10μg/mL生物素化的EpCAM抗体的磷酸缓冲盐溶液，反应时间分别为30～60min，从而获得修饰抗体的纳米结构基板；(3)芯片封装：将步骤(2)制备的修饰抗体的纳米结构基板和载玻片或嵌入光纤的PDMS之间用多层封口膜进行隔...
【专利技术属性】
技术研发人员：董彪，许红威，徐诗函，宋宏伟，白雪，徐琳，孙雪珂，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。