本发明专利技术公开一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，是一种利用细胞培养反应器悬浮培养霍山石斛细胞来生产霍山石斛生物碱的方法。包括以下步骤：(1)单细胞制备(2)单细胞系培养(3)细胞群放大培养(4)提取霍山石斛生物碱：当细胞密度达到60000‑80000个/ml收集霍山石斛细胞，降低培养温度至7‑10℃，继续培养5‑7天，提取霍山石斛生物碱。本发明专利技术能够大幅度缩短细胞培养周期，提高霍山石斛生物碱产品收率，且工艺简单、稳定，适合工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及霍山石斛
，尤其涉及一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法。
技术介绍
霍山石斛生物碱类是霍山石斛的主要成分之一，生物碱的药理作用主要表现在抗肿瘤、对心血管、胃肠道抑制作用及止痛退热等作用。随着社会发展，人们对健康的关注越来越高，其需求量也会越来越大，但传统霍山石斛生物碱类的提取方法是用霍山石斛的根、茎、叶等植物体提取所得，这种工艺所得的产品已经不能满足未来市场对霍山石斛精深加工的需求。随着植物细胞工程技术的发展，用细胞进行人工培养扩增提取植物的代谢产物，可以不受土地面积、气候环境、地域、病虫害等限制影响，适于工业化生产。利用细胞工程技术生产石斛生物碱类的技术，在国内外早有研究，也取得了诸多成果，但在生产过程中存在很多难题问题，如工艺复杂、生物量增速低、目标产物收率低、生产周期长等。关于利用气升搅拌罐悬浮培养霍山石斛细胞生产霍山石斛生物碱的研究还没有报道，因此开发一种高效生产霍山石斛中生物碱类天然产物的方法是十分有意义的。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种工艺简单、稳定，适合工业化生产
悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法。本专利技术通过以下技术手段去解决上述技术问题的：一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，包括以下步骤：(1)单细胞制备：取霍山石斛蒴果消毒后用固体培养基进行无菌播种，待萌发成原球茎后取出，采用酶解法分离制备单细胞，并离心过滤除杂，收集单细胞；(2)单细胞系培养：将收集到的单细胞接种到第一MS液体培养基中培养；(3)细胞群放大培养：将培养好的单细胞系接种于第二MS液体培养基中培养；所述第二MS液体培养基中的P元素含量为MS液体培养基的2-3倍，所述第二MS液体培养基中还添加有1-2mg/L的锗元素、0.02-0.1mg/L硒元素和0.1-0.2g/L的酸水解酪蛋白，pH值为5.8±0.4。使用本专利技术的第二MS液体培养基，相对于MS液体培养基能延长分批培养细胞生长时间2倍以上，提高细胞密度2倍以上。锗元素、硒元素、酸水解酪蛋白能够显著增加霍山石斛悬浮细胞的鲜重、提高蛋白质和叶绿素的含量,使细胞抗氧化活性明显升高。(4)提取霍山石斛生物碱：当细胞密度达到60000-80000个/ml，降低培养温度至7-10℃，继续培养5-7天，采用离心收集霍山石斛细胞；再提取霍山石斛生物碱。由于生物碱是次级代谢产物，与细胞生长不偶联，降低培养温度至该温度范围内，使细胞不增长，能促使生物碱产物的产生。优选地，所述步骤(1)播种采用的培养基为适合兰科植物生长的固体培养基。优选地，所述固体培养基为1/2MS培养基。1/2MS培养基中大量元素减半，适合兰科植物种子萌发。优选地，所述步骤(2)中单细胞接种量为25±2g/L，光强度为2000-4000lux，色温为4000-6000K，震荡培养，温度22±2℃，当细胞密度达到10000-20000个/mL，即可放大培养。该光强度范围有助于细胞的形态建成和活力提升，过高则浪费，过低则达不到效果。该色温为暖光，蓝紫光较为均衡，有利于代谢产物的合成。该温度范围为霍山石斛生长和代谢最为均衡的温度。该密度下，细胞的群体生长处于指对数时期，即活力最旺盛的时期。优选地，所述步骤(3)中单细胞系接种量为30±2g/L，光强度为2000-4000lux，色温为4000-6000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30％。优选地，所述第二MS液体培养基中还添加有0.1-2mg/L NAA、0.1-2mg/L 6-BA、50-100mg/L果胶酶、10-50mg/L纤维素酶，pH值为5.8±0.4。添加植物生长调节剂和生物酶制剂到培养基中，能激活细胞分裂生长，并防止细胞聚集结块，保证营养和溶氧和二氧化碳供应均匀、充分。优选地，所述锗元素来源于GeO2或有机锗。优选地，所述硒元素来源于Na2SeO3或有机硒。本专利技术的优点在于：本专利技术首先对霍山石斛种子无菌播种萌发形成的原球茎，利用酶解法分离出高活力原球茎中的单细胞，进一步培养成单细胞系，最后进行细胞群放大培养，在放大培养中，添加植物生长调节剂和生物酶制剂到培养基中，能激活细胞分裂生长，并防止细胞聚集结块，保证营养和溶氧和二氧化碳供应均匀、充分。本专利技术能够大幅度缩短细胞培养周期，提高产品收率，
且工艺简单、稳定，适合工业化生产。具体实施方式本专利技术生物碱含量的检测方法1、对实施例提取的生物碱进行分析，具体分析方法如下。标准品配制：精密称取石斛碱标准品1.00mg置100mL量瓶中加氯仿至刻度。标准曲线的绘制：精密量取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL分别置分液漏斗中,用氯仿准确稀释至10.0mL,加入pH 4.5缓冲液5.0mL和0.04％溴甲酚绿溶液1.0mL,剧烈振摇3min,静置30min,氯仿层经氯仿浸泡处理并干燥后的药棉滤过,取续滤液5.0mL加0.01molL-1氢氧化钠无水乙醇液1.0mL摇匀,以氯仿10.0mL为空白,同法操作,于波长620nm处测得吸收度。由吸光度X对浓度Y(ug/ml)进行回归计算，得到标准曲线方程：Y＝0.6321X-0.0132，r＝0.99914。2、样品的测定：称取本实验制得的霍山石斛生物碱样品50mg，稀释至溶液吸光值在标准曲线范围内(10-100倍)稀释后，按上述方法进行测定。每个样品测试10次，取线性范围内的值求均值。实施例1本实施例公开一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，包括以下步骤：1、培养阶段(1)单细胞制备取霍山石斛蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为固体1/2MS培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力
旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用80微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；(2)单细胞系培养将收集到的单细胞接种到含有第一MS液体培养基的挡板摇瓶中，单细胞接种量为23g/L，光强度为2000lux，色温为4000K，震荡培养，调pH值为5.4，温度20℃，当细胞密度达到10000个/mL，即可放大培养；(3)细胞群放大培养：将培养好的单细胞系接种于含有第二MS(该MS液体培养基中的P元素为常规MS液体培养基的2倍)+0.1mg/LNAA(1-Naphthaleneacetic acid，萘乙酸)+0.1mg/L 6-BA(6-Benzylaminopurine，6-苄氨基嘌呤)+50mg/L中性果胶酶+10mg/L中性纤维素酶+1mg/L的锗元素(来源于GeO2)+0.02mg/L硒元素(来源于Na2SeO3)+0.1g/L的酸水解酪蛋白的液体培养基的30L气升式搅拌发酵罐中，鲜细胞接种量为28g/L，光强度为2000lux，色温为4000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶O2在30％，溶CO2在3％，调节补料液流加量保持糖含量在3％和NaOH溶液流加量保持pH在5.4；补料液为2倍浓度的第二MS液体培养基；(4)当细胞密度达到60000个/ml,经测定每毫升培养液中细胞鲜重0.53g/mL、每克鲜细胞中蛋白质含量11.9mg/g、每克本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)单细胞制备：取霍山石斛蒴果消毒后用固体培养基进行无菌播种，待萌发成原球茎后取出，采用酶解法分离制备单细胞，并离心过滤除杂，收集单细胞；(2)单细胞系培养：将收集到的单细胞接种到第一MS液体培养基中培养；(3)细胞群放大培养：将培养好的单细胞系接种于第二MS液体培养基中培养；所述第二MS液体培养基中的磷元素含量为MS液体培养基的2‑3倍，所述第二MS液体培养基中还添加有1‑2mg/L的锗元素、0.02‑0.1mg/L硒元素和0.1‑0.2g/L的酸水解酪蛋白，pH值为5.8±0.4；(4)提取霍山石斛生物碱：当细胞密度达到60000‑80000个/ml，降低培养温度至7‑10℃，继续培养5‑7天，采用离心收集霍山石斛细胞；再提取霍山石斛生物碱。
【技术特征摘要】
1.一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)单细胞制备：取霍山石斛蒴果消毒后用固体培养基进行无菌播种，待萌发成原球茎后取出，采用酶解法分离制备单细胞，并离心过滤除杂，收集单细胞；(2)单细胞系培养：将收集到的单细胞接种到第一MS液体培养基中培养；(3)细胞群放大培养：将培养好的单细胞系接种于第二MS液体培养基中培养；所述第二MS液体培养基中的磷元素含量为MS液体培养基的2-3倍，所述第二MS液体培养基中还添加有1-2mg/L的锗元素、0.02-0.1mg/L硒元素和0.1-0.2g/L的酸水解酪蛋白，pH值为5.8±0.4；(4)提取霍山石斛生物碱：当细胞密度达到60000-80000个/ml，降低培养温度至7-10℃，继续培养5-7天，采用离心收集霍山石斛细胞；再提取霍山石斛生物碱。2.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，所述步骤(1)播种采用的培养基为适合兰科植物生长的固体培养基。3.根据权利要求2所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，所述固体培养基为1/2MS固体培养基。4.根据权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓辉，陈乃富，陈存武，韩邦兴，何晓梅，
申请(专利权)人：皖西学院，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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