一种3‑氨基‑2‑恶唑烷酮免疫检测方法技术

本发明专利技术公开了一种3‑氨基‑2‑恶唑烷酮免疫检测方法，呋喃唑酮在动物体内迅速代谢为3‑氨基‑2‑恶唑烷酮(AOZ)，检测呋喃唑酮的残留实际上是检测AOZ的残留。本发明专利技术的检测方法是将待检物中的3‑氨基‑2‑恶唑烷酮(AOZ)提取后改用3‑醛基苯甲酸甲酯进行衍生化，得到3‑醛基苯甲酸甲酯‑3‑氨基‑2‑恶唑烷酮(PCPME‑AOZ)，然后再测定该衍生物的含量。以NP‑AOZ和PCPME‑AOZ为标准品进行间接竞争酶联免疫吸附测定(icELISA)，结果证明用本发明专利技术的检测方法能够显著提高呋喃唑酮残留即3‑氨基‑2‑恶唑烷酮(AOZ)免疫检测的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及含有呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮的检测方法及其应用。
技术介绍
呋喃唑酮(痢特灵)是一种硝基呋喃类抗生素，为广谱抗菌药。3-氨基-2-恶唑烷酮(3-Amino-2-oxazolidinon,AOZ)是呋喃唑酮在动物体内的代谢物。呋喃唑酮可用于治疗细菌和原虫引起的痢疾、肠炎、胃溃疡等胃肠道疾患。对常见的革兰氏阴性菌和阳性菌有抑制作用。对毛滴虫、贾第鞭毛虫也有一定的活性。其作用机制为干扰细菌氧化还原酶从而阻断细菌的正常代谢。人口服呋喃唑酮吸收率低，通过血液循环主要停留在肠道内。但该药物对肝、肾刺激大、易充血及发生体内糖代谢及神经病变作用，并可在体内残留。过量使用呋喃唑酮可能会导致胃肠道反应；溶血性贫血、皮疹、药热等过敏反应；多发性神经炎；新生儿和G-6-PH缺乏可致溶血性贫血。实验证明，硝基呋喃类药物及其代谢产物具有致癌和致突变的特性。由于呋喃唑酮的毒副作用，各国政府都采取了相关管制政策。美国在1975年和1993年分别禁止了呋喃唑酮作为医药和兽药使用。日本在1977年禁止了呋喃唑酮的使用。2002年，中华人民共和国农业部将呋喃唑酮列为禁止使用的药物，不得在动物性食品中检出。中华人民共和国食品药品监督总局也于2002年禁止了硝基呋喃类(包括呋喃唑酮)在动物性食品中的使用。但是，硝基呋喃类药物药效显著、价格低廉，能在动物体内迅速代谢从而难以检测。我国的养殖业中，仍有一些不法分子在利益的驱使下滥用了呋喃唑酮药物，对消费者的健康带来了极大的隐患，同时也严重损害了农产品进出口贸易。因此市场上急需一种高效快速灵敏的呋喃唑酮药物残留的检测方法。由于酶联免疫吸附检测(ELISA)是一种具有突出优势的检测方法。该方法具有快速、简单、准确、高通量、无需专业操作等优点，使得它成为一种理想的市场监查检测方法。国家标准(GB/T 20752-2006，猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定)等的文献报道，把AOZ提取出来，在提取后用邻硝基苯甲醛作为衍生剂，与AOZ发生成肟反应从而生成NP-AOZ，
但是NP-AOZ的酶联免疫吸附检测不够灵敏。本专利技术创新地运用了一种呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮的检测方法，使得相应的ELISA检测灵敏度大幅度提高。因此，本专利技术建立的酶联免疫吸附检测方法可以大大提高检测准确性，为各层监督单位提供快速、高效、准确的检测方法，具有不可估量的市场价值。
技术实现思路
为了使得用于检测如动物源性食品及其加工产品等样品中AOZ残留的icELISA具有更高的灵敏度，本专利技术创新了一种3-氨基-2-恶唑烷酮的处理方法，使得icELISA更加高效更适宜于实际样品的检测。本专利技术所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法如下，将待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮通过肟反应衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮后进行酶联免疫吸附检测，以测定待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮含量。本专利技术中用3-醛基苯甲酸甲酯与待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮发生肟反应。本专利技术所述的酶联免疫吸附检测为间接竞争酶联免疫吸附(icELISA)测定。本专利技术的待测样品的获取方法为将待检物与甲醇-水混合溶液混合研匀，离心后的沉淀物为待测样品。本专利技术的待测样品肟反应的操作方法步骤包括：1)将沉淀物与盐酸溶液混合研匀；2)再与3-醛基苯甲酸甲酯混匀后旋干；3)再加入1,4-二氧六环在氮气保护条件下加热回流，减压旋转蒸发得到固体粉末；4)向步骤(3)的固体粉末中加入乙醇溶解；5)抽滤获取白色固体为含有衍生得到的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮的物质。本专利技术所述的酶联免疫吸附检测中用完全抗原AOZ-3-醛基苯甲酸-BSA免疫动物体获得抗血清。所述的酶联免疫吸附检测为基于上述抗血清的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮间接竞争酶联免疫吸附反应。本专利技术所述的酶联免疫吸附检测中以完全抗原AOZ-3-醛基苯甲酸-OVA作为固相抗原。本专利技术所述的酶联免疫吸附检测中以3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮
为竞争性抑制物，以抗血清为一抗，以IgG-HRP为酶标二抗。本专利技术所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法的应用，尤其在于将待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮通过肟反应衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮后进行酶联免疫吸附检测在3-氨基-2-恶唑烷酮快速检测试剂盒方面的应用。以上检测方法及其应用具有快速、简单、准确、高通量、无需专业操作等优点，使得它成为一种理想的市场监查检测方法。附图说明图1为3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)的化学式；图2为3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮(PCPME-AOZ)的化学式；图3为邻硝基苯甲醛-3-氨基-2-恶唑烷酮(NP-AOZ)的化学式；图4为以PCPME-AOZ为标准抑制物的抗血清icELISA标准曲线；图5为以NP-AOZ为标准抑制物的抗血清icELISA标准曲线具体实施方式本专利技术中出现的技术术语及相关试剂配方如下：AOZ:3-氨基2-恶唑烷酮(3-Amino-2-oxazolidinon)；BSA：牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)，分子量约为66.43kDa；OVA：卵白蛋白(Albumin,from chicken egg white)，分子量约为44kDa；Tween-20:吐温20；Gelatin：明胶；DMEM:Dulbecco’s modified Eagle’s medium,细胞培养液；PEG:聚乙二醇2000；HAT:hypoxanthine(次黄嘌呤),aminopterin(氨基喋呤),thymidine(胸腺嘧啶)；PBS:磷酸盐缓冲液(NaCl 137mM,KH2PO4 1.5mM,Na2HPO4·12H2O 8.3mM,pH 7.5)；PBST:PBS溶液中加入0.1％的Tween-20；PBSTG:PBST溶液中加入0.1％的明胶；包被缓冲液：1.5g Na2CO3、2.93g NaHCO3溶于1000mL水，pH 9.6；底物缓冲液：5.1g一水合柠檬酸、18.43g Na2HPO4·12H2O、1.0mL Tween-20溶于1000mL水，pH 5.0；文中出现的所有试剂及仪器设备均可配制或市购获得，本专利技术具体实施例中所使用的试剂均购买于Sigma公司。试验例1：待检物中3-氨基2-恶唑烷酮的获取及其衍生物3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮(PCPME-AOZ)的获取。可参考国家标准(GB/T 20752-2006)的文献报告，用文献中的方法把3-氨基2-恶唑烷酮提取出来，方法可以是(1)收集市场中或实验室制备的待检物，置于棕色离心管中，加入甲醇-水混合溶液(甲醇与水的混合体积比为2：1)，研均，再用甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并后离心，吸取上清液弃掉。(2)向上述离心管中加入盐酸溶液，研均，用盐酸溶液洗涤均质刀头，二者合并。(3)把步骤(2)中的混合液中加入3-醛基苯甲酸甲酯,混匀后旋干。加入干燥的1,4-二氧六环(1,4-dioxane)到反应瓶中，在氮气保护条件下，加热回流。(4)用减压旋转蒸发仪脱溶剂得到固本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种3‑氨基‑2‑恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于，将待测样品中的3‑氨基‑2‑恶唑烷酮通过肟反应衍生得到3‑醛基苯甲酸甲酯‑3‑氨基‑2‑恶唑烷酮后进行酶联免疫吸附检测，以测定待测样品中的3‑氨基‑2‑恶唑烷酮含量。

【技术特征摘要】
1.一种3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于，将待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮通过肟反应衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮后进行酶联免疫吸附检测，以测定待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮含量。2.如权利要求1所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于，用3-醛基苯甲酸甲酯与待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮发生肟反应。3.如权利要求1所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于，所述的酶联免疫吸附检测为间接竞争酶联免疫吸附测定。4.如权利要求2所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于：待测样品的获取方法为将待检物与甲醇-水混合溶液混合研匀，离心后的沉淀物为待测样品。5.如权利要求4所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于，所述的待测样品肟反应的操作方法步骤包括：1)将沉淀物与盐酸溶液混合研匀；2)再与3-醛基苯甲酸甲酯混匀后旋干；3)再加入1,4-二氧六环在氮气保护条件下加热回流，减压旋转蒸发得到固体粉末；4)向步骤(3)的固体粉末中加入乙醇溶解；5)抽滤获取白色固体为含有衍生得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：王保民，张威，陈俊玉，王冕，谢紫君，杨涛，宁香雪，郭素琴，谭桂玉，丹阳，
申请(专利权)人：福建安欣睿捷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35