一种规模化生产普伐他汀的工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种规模化生产普伐他汀的工艺，其包括发酵、提取和精制步骤，其中发酵工艺中使用由冬瓜皮水提取液和西瓜皮水提取液组成的植物提取液，有效提高微生物对底物康百汀的耐药性和转化能力以及普伐他汀发酵水平，从而增加普伐他汀产量，在提取和精制步骤中，严格控制溶液的pH值、有机溶剂的种类与用量、萃取时间和温度以及降温操作和结晶时间，保证普伐他汀的收率与纯度。本发明专利技术工艺稳定，成本低廉，实现了普伐他汀的规模化、工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种规模化生产普伐他汀的工艺
本专利技术涉及药物制备
，具体涉及一种规模化生产普伐他汀的工艺。
技术介绍
普伐他汀是3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，最初用于治疗高血脂症和家族性高胆固醇，后来适应症不断扩大，可以减缓动脉粥样硬化的发展，减少冠状动脉粥样硬化病变和临床心血管事件的发生。普伐他汀的生产通常由两步发酵过程获得，虽然也有报道或专利(WO99/10499、WO2007/147827、US6,274,360和EP1,266,967)描述可用一步发酵的方法生产获得普伐他汀，但由于技术复杂及生产效率等原因，普伐他汀的工业化生产仍以两步发酵为主。普伐他汀的两步发酵过程为：首先，通过桔青霉(Penicilliumcitrinum)等微生物发酵生产获得其次级代谢产物康百汀Compactin(又名美伐他汀Mevastatin)，然后，通过微生物酶的转化作用，将康百汀转化为普伐他汀。现有的专利或文献资料公开的将康百汀转化为普伐他汀的微生物主要包括以下几类：丝状霉菌(Mortierellamaculata，WO00/46175)、根毛霉菌(MucorRhizopus，US4448979)、诺卡氏菌(Norcardia，US5830695)、马杜拉放线菌(Actinomadura，WO96/40863)、链霉菌(StreptomycesCarbopilusEP215665)、脱叶链霉菌(Streptomycesexfoliates，WO98/45410)和粉白小多孢菌(Micropolysporaroseoalba，CN03141475A)等。按照公开的专利，上述的霉菌、丝状细菌、放线菌和链霉菌均可以将康百汀转化成普伐他汀，然而，由于康百汀对微生物转化菌的毒害作用，使得微生物不能耐受添加到培养物中的甚至是低浓度的康百汀，现有技术下微生物转化菌对底物康百汀的耐受浓度为0.01-0.05％。李周灵等(WO98/45410)获得的脱叶链霉菌YJ-118表现了较高(0.1-0.5％)的底物抗性，Metkinen(MetkinenNewsMarch2000，MetkinenOy，Finland；reviewedbyManzoniandRollini，2002，ApplMicrobiolBiotechnol58：555-564)也获得了对3g/L康百汀具有抗性的Streptomyces突变菌株，但其普伐他汀产率不高。WO96/40863公开了马杜拉放线菌(Actinomadura)ATCC55678转化康百汀生产普伐他汀的方法，中国专利CN102757986B公开了以马杜拉放线菌为转化菌，在发酵过程中使用微量元素溶液以提高普伐他汀的产量的方法，同时其也研究了发酵培养过程分别控制菌体增殖培养温度和康百汀转化温度对普伐他汀产量提高的有益作用，通过该工艺，康百汀的转化率达70％以上，普伐他汀发酵生产水平达18g/L以上，然而，该微量元素溶液的配方复杂，配制过程繁琐，容易引起操作失误，并且原料成本较高，限制了普伐他汀的大规模生产应用。同时，利用马杜拉放线菌转化康百汀生产普伐他汀的发酵工艺结束后需要对发酵液进行提取和精制才能得到最终产物，然而从发酵液中提取、精制普伐他汀过程中所用的有机溶剂、操作温度和时间等均会对产物的收率和品质产生影响，而现有技术中又没有一套完整的普伐他汀生产工艺。综上，有必要研发一种有效提高微生物对底物康百汀的耐药性和转化能力以及普伐他汀发酵水平，降低普伐他汀生产成本、增加普伐他汀产量的可规模化生产普伐他汀的工艺。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种规模化生产普伐他汀的工艺，其有效提高微生物对底物康百汀的耐药性和转化能力以及普伐他汀发酵水平，降低了普伐他汀生产成本，增加了普伐他汀产量，且工艺稳定，可大规模化生产。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种规模化生产普伐他汀的工艺，包括以下步骤：S1、发酵：A1.种子培养：按照如下配方配制种子培养基：葡萄糖24～26g/L、酵母提取物20～22g/L、大豆蛋白胨6～8g/L、K2HPO4·3H2O1～2g/L、MgSO4·7H2O0.5～1g/L和消沫剂1.0g/L，调节pH7.0～7.2；向种子培养基中接种马杜拉放线菌，接种后在33～35℃下培养48～72小时，得到种子液；A2.发酵培养：按照如下配方配制发酵培养基：葡萄糖56～60g/L、酵母提取物20～24g/L、大豆蛋白胨6～8g/L、K2HPO4·3H2O1～2g/L、MgSO4·7H2O0.5～1g/L、(NH4)2SO41～2g/L、植物提取液4～8ml/L和消沫剂1.0g/L，调节pH7.0～7.2；向发酵培养基中接种A1得到的种子液，接种后先在33～35℃下增殖培养30～40小时，然后加入康百汀溶液，在33～35℃下培养72～156小时，培养过程控制康百汀在发酵液中的浓度为0.7～0.9g/L，发酵培养结束后得到发酵液；S2、提取：B1.调节S1所得发酵液的pH至2～5，加入硅藻土后过滤，收集滤饼，往滤饼中加入滤饼重量6～10倍量的有机溶剂一，在90～120℃下萃取3～5h，萃取结束过滤，得到滤液，滤液在40～80℃下真空浓缩至浓缩液的体积为滤液体积的1/6～1/3，得到浓缩液；B2.往B1得到的浓缩液中加入活性炭，搅拌1～2h，过滤并洗涤，滤液在40～80℃下真空浓缩至浓缩液的体积为滤液体积的1/6～1/3，得到浓缩液；B3.将B2得到的浓缩液降温至5～10℃，并保温结晶6～10h，过滤得到湿晶体，湿晶体在60～70℃下干燥至干燥失重≤1％，得到粗品；B4.往B3得到的粗品加入粗品重量6～8倍量的有机溶剂二，升温溶解，溶解液降温至5～10℃，并保温结晶6～10h，过滤得到湿晶体，湿晶体在60～70℃下干燥至干燥失重≤1％，得到中间体；S3、精制：往S2得到的中间体加入中间体重量4～8倍量的有机溶剂三，升温溶解，然后调节溶解液pH至9～11，溶解液降温至5～10℃，并保温结晶6～10h，过滤得到湿晶体，湿晶体在60～70℃下干燥至干燥失重≤1％，得到普伐他汀。进一步的，所述植物提取液为冬瓜皮提取液和西瓜皮提取液的组合物，所述冬瓜皮提取液和西瓜皮提取液的体积比为(3～5)∶1。再进一步的，所述冬瓜皮提取液和西瓜皮提取液的体积比为4∶1。再进一步的，所述冬瓜皮提取液的制备方法如下：取冬瓜皮，加入其重量4～6倍量的水，浸泡1h，然后加热，回流提取0.5～1h，提取液使用8层纱布过滤，得到冬瓜皮提取液。再进一步的，所述西瓜皮提取液的制备方法如下：取西瓜皮，加入其重量4～6倍量的水，浸泡1h，然后加热，回流提取0.5～1h，提取液使用8层纱布过滤，得到西瓜皮提取液。进一步的，所述有机溶剂一为甲苯、乙酸乙酯或乙酸丁酯。进一步的，所述有机溶剂二为甲醇、乙醇或丁醇。进一步的，所述有机溶剂三为甲醇、乙醇或丁醇和水的混合液，其中水占混合液重量的3～10％。在本专利技术的技术方案中，所述冬瓜皮为葫芦科植物冬瓜的干燥外层果皮，所述西瓜皮是葫芦科植物西瓜的干燥外层果皮。由于冬瓜皮和西瓜皮不能直接食用，所以一般会被人们扔弃，然而冬瓜皮和西瓜皮中含有丰富的糖类，还有钠、钾、钙、铁、锰、锌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种规模化生产普伐他汀的工艺，其特征在于，包括以下步骤：S1、发酵：A1.种子培养：按照如下配方配制种子培养基：葡萄糖24～26g/L、酵母提取物20～22g/L、大豆蛋白胨6～8g/L、K2HPO4·3H2O 1～2g/L、MgSO4·7H2O 0.5～1g/L和消沫剂1.0g/L，调节pH7.0～7.2；向种子培养基中接种马杜拉放线菌，接种后在33～35℃下培养48～72小时，得到种子液；A2.发酵培养：按照如下配方配制发酵培养基：葡萄糖56～60g/L、酵母提取物20～24g/L、大豆蛋白胨6～8g/L、K2HPO4·3H2O 1～2g/L、MgSO4·7H2O 0.5～1g/L、(NH4)2SO4 1～2g/L、植物提取液4～8ml/L和消沫剂1.0g/L，调节pH7.0～7.2；向发酵培养基中接种A1得到的种子液，接种后先在33～35℃下增殖培养30～40小时，然后加入康百汀溶液，在33～35℃下培养72～156小时，培养过程控制康百汀在发酵液中的浓度为0.7～0.9g/L，发酵培养结束后得到发酵液；S2、提取：B1.调节S1所得发酵液的pH至2～5，加入硅藻土后过滤，收集滤饼，往滤饼中加入滤饼重量6～10倍量的有机溶剂一，在90～120℃下萃取3～5h，萃取结束过滤，得到滤液，滤液在40～80℃下真空浓缩至浓缩液的体积为滤液体积的1/6～1/3，得到浓缩液；B2.往B1得到的浓缩液中加入活性炭，搅拌1～2h，过滤并洗涤，滤液在40～80℃下真空浓缩至浓缩液的体积为滤液体积的1/6～1/3，得到浓缩液；B3.将B2得到的浓缩液降温至5～10℃，并保温结晶6～10h，过滤得到湿晶体，湿晶体在60～70℃下干燥至干燥失重≤1％，得到粗品；B4.往B3得到的粗品加入粗品重量6～8倍量的有机溶剂二，升温溶解，溶解液降温至5～10℃，并保温结晶6～10h，过滤得到湿晶体，湿晶体在60～70℃下干燥至干燥失重≤1％，得到中间体；S3、精制：往S2得到的中间体加入中间体重量4～8倍量的有机溶剂三，升温溶解，然后调节溶解液pH至9～11，溶解液降温至5～10℃，并保温结晶6～10h，过滤得到湿晶体，湿晶体在60～70℃下干燥至干燥失重≤1％，得到普伐他汀。...

【技术特征摘要】
1.一种规模化生产普伐他汀的工艺，其特征在于，包括以下步骤：S1、发酵：A1.种子培养：按照如下配方配制种子培养基：葡萄糖24～26g/L、酵母提取物20～22g/L、大豆蛋白胨6～8g/L、K2HPO4·3H2O1～2g/L、MgSO4·7H2O0.5～1g/L和消沫剂1.0g/L，调节pH7.0～7.2；向种子培养基中接种马杜拉放线菌，接种后在33～35℃下培养48～72小时，得到种子液；A2.发酵培养：按照如下配方配制发酵培养基：葡萄糖56～60g/L、酵母提取物20～24g/L、大豆蛋白胨6～8g/L、K2HPO4·3H2O1～2g/L、MgSO4·7H2O0.5～1g/L、(NH4)2SO41～2g/L、植物提取液4～8ml/L和消沫剂1.0g/L，调节pH7.0～7.2；向发酵培养基中接种A1得到的种子液，接种后先在33～35℃下增殖培养30～40小时，然后加入康百汀溶液，在33～35℃下培养72～156小时，培养过程控制康百汀在发酵液中的浓度为0.7～0.9g/L，发酵培养结束后得到发酵液；S2、提取：B1.调节S1所得发酵液的pH至2～5，加入硅藻土后过滤，收集滤饼，往滤饼中加入滤饼重量6～10倍量的有机溶剂一，在90～120℃下萃取3～5h，萃取结束过滤，得到滤液，滤液在40～80℃下真空浓缩至浓缩液的体积为滤液体积的1/6～1/3，得到浓缩液；B2.往B1得到的浓缩液中加入活性炭，搅拌1～2h，过滤并洗涤，滤液在40～80℃下真空浓缩至浓缩液的体积为滤液体积的1/6～1/3，得到浓缩液；B3.将B2得到的浓缩液降温至5～10℃，并保...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐会根，罗定军，黄智勇，陈继敏，李耀荣，熊志，叶家雄，
申请(专利权)人：广东蓝宝制药有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44