高产麦考酚酸的基因工程菌、构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种高产麦考酚酸的基因工程菌，以短密青霉为宿主细胞，一个表达氧化裂解酶的MpaB基因与pPK2质粒形成的重组质粒pPKCMH，由经过截短的Pgpd启动子(PgpdT)启动MpaB基因的表达，所述的重组质粒经根癌农杆菌GV3101介导转移。本发明专利技术还提供了相应的基因工程菌的构建方法和应用。本发明专利技术的高产麦考酚酸的基因工程菌，可以显著提升麦考酚酸合成基因簇中MpaB基因表达量，并积极提高麦考酚酸的产量。并且，本发明专利技术提供的构建方法中，基于分子构建，无需繁琐操作，显著提升产量，具有良好的工业应用价值。业应用价值。业应用价值。

【技术实现步骤摘要】
高产麦考酚酸的基因工程菌、构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种高产麦考酚酸的基因工程菌、构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]麦考酚酸(Mycophenolic Acid，MPA)为短密青霉(Penicillium brevicompactum)产生的一种抗生素，具有抗真菌、抗肿瘤和免疫抑制作用。麦考酚酸可以非竞争性地结合次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶，以对淋巴细胞活性起到抑制作用。它的2
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吗啉代乙酯类衍生物——麦考酚酸酯(Morpholinoethyl Ester of Mycophenolic Acid,MMF)是新一代免疫抑制剂。麦考酚酸酯在体内通过转化为麦考酚酸而发挥免疫抑制活性。目前在国内外器官移植中，MMF已经得到广泛的应用，这也使得麦考酚酸的生产方法及其高产菌株的构建得到业界的广泛关注。
[0003]麦考酚酸的药物代谢动力学特征：麦考酚酸酯(MMF)经口服吸收较完全，进入体内后很快被代谢为活性成分MPA，99.99％的MPA分布于血浆中，MPA与血浆蛋白结合率为97％～99％，在肠道、肝脏和肾脏中主要被二磷酸鸟苷
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葡萄糖醛酸转移酶(uridinediphosphategluconosyltran
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Chemicalbooksferases，UGTs)代谢为霉酚酸葡萄糖苷酸(mycophenolicacidglucuronide，MPAG)，另外还有少量代谢为7
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O
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葡萄糖苷
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霉酚酸和霉酚酸酰基葡萄糖苷酸(mycophenolicacidacylglucuronide，AcMPAG)，MPA在体内有肝肠循环，其代谢物通过肝内多药耐药相关蛋白2(multi
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drugresistanceprotein2，MRP
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2)转运入胆汁，随胆汁排入肠道后经细菌分解为MPA，并再次经血液循环进入肝脏，因而在用药后4～12h出现MPA的第二个峰浓度，使MPA的体内暴露量升高近40％。最终约93％MPA经尿液排出，其中以MPAG形式排出的占87％，少量通过粪便排出(约6％)。
[0004]目前麦考酚酸的生产主要基于生物合成法，即真菌的发酵，其中高效生产麦考酚酸的有：短密青霉(Penicillium brevicompactum)以及娄地青霉菌(Penicillium roqueforti)等青霉菌。产物从发酵液中的提取主要是溶媒浸提之后分离的方法，目前也被广泛应用于各种生物合成产品的分离。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服上述现有技术中的至少一个缺点，提供一种高产麦考酚酸的基因工程菌、构建方法及其应用。
[0006]本专利技术提供了一种高产麦考酚酸的基因工程菌，主要特点是，以短密青霉(Penicillium brevicompactum)为宿主细胞，表达由MpaB基因和质粒pPK2形成的重组质粒pPKCMH，由经过截短的Pgpd启动子启动MpaB基因的表达，所述的重组质粒经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101介导转移。
[0007]其中，MpaB基因(氧化裂解酶类)是原生于麦考酚酸合成基因簇的一个基因。
[0008]优选地，所述的截短的Pgpd启动子具体为：来自于构巢曲霉3
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磷酸甘油脱氢酶ATG
上游2156bp的核苷酸序列为初始启动子序列，在
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1046bp处截短，形成所述的截短的Pgpd启动子。
[0009]本专利技术还提供了一种高产麦考酚酸的基因工程菌的构建方法，其主要特点是，所述的构建方法包括：由MpaB基因与截短的Pgpd启动子PgpdT和TtrpC终止子和pPK2质粒形成重组质粒，所述的重组质粒经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101介导转移至短密青霉(Penicillium brevicompactum)中，增加产物合成基因簇中MpaB基因的拷贝数，形成高产麦考酚酸的基因工程菌Penicillium brevicompactum pPKCMH
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PgpdT
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MpaB
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Ttrpc。
[0010]所述的MpaB基因从短密青霉中扩增得到。
[0011]所述的PgpdT为Pgpd截短的启动子，来自于构巢曲霉3
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磷酸甘油脱氢酶ATG上游2156bp的核苷酸序列为初始启动子序列，在
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1046bp处截短，形成所述的截短的Pgpd启动子。
[0012]所述的由MpaB基因和pPK2质粒形成重组质粒，具体为：
[0013]将MpaB基因、经过截短的3
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磷酸甘油脱氢酶启动子PgpdT、巢曲霉色氨酸合成基因终止子Ttrpc连在丝状真菌穿梭表达载体pPK2的多克隆位点处，得到所述的重组质粒pPKCMH。
[0014]接下来，将重组质粒pPK
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CMH转化根癌农杆菌GV1301中，得到重组的根癌农杆菌，利用根癌农杆菌的结合转移的功能，将重组质粒中的RB和LB之间的载体片段转移进短密青霉中以得到重组的短密青霉。
[0015]本专利技术提供的构建方法具体包括以下步骤：
[0016]1、MpaB基因，启动子PgpdT以及终止子Ttrpc的克隆：
[0017]根据Genebank公布的短密青霉麦考酚酸合成基因簇中的MpaB基因序列，设计合成引物：
[0018]P1：gagcagacatcaccATGTCTTTGTCTTTGCCTCCAGC
[0019]P2：CTAATGGAAGGGACATTTCCCC
[0020]根据Genebank公布的来自于构巢曲霉的Pgpd的基因序列，经过截短之后，依据截短的启动子序列，设计并合成引物：
[0021]P3：cgaattcttaattaagatatcCCAAATCTGTCCAGATCATGGT
[0022]P4：agacatGGTGATGTCTGCTCAAGCGG
[0023]根据Genebank公布的来自于构巢曲霉的Ttrpc的基因序列，设计并合成引物：
[0024]P5：ggaaatgtcccttccattagTGATTTAATAGCTCCATGTCAACAA
[0025]P6：ccgggtaccgagctcgatatcGTCTAGAAAGAAGGATTACCTCTAA
[0026]在引物P1和P6的两端引入与质粒pPK2多克隆位点中的KpnI酶切位点的同源重组片段，以短密青霉和质粒pPK2为模板完成PCR反应：
[0027]PCR的反应体系是：Buffer 25μL，ddH2O 18μL，模板1μL，上下游引物各2μL，dNTPs 1μL，High fidelity enzyme 1μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产麦考酚酸的基因工程菌，其特征在于，以短密青霉为底盘细胞，表达由MpaB基因和pPK2质粒形成的重组质粒pPKCMH，由经过截短的Pgpd启动子启动MpaB基因的表达，所述的重组质粒pPKCMH经根癌农杆菌GV3101介导转移。2.根据权利要求1所述的高产麦考酚酸的基因工程菌，其特征在于，所述的截短的Pgpd启动子具体为：来自于构巢曲霉3
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磷酸甘油脱氢酶ATG上游2156bp的核苷酸序列为初始启动子序列，在
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1046bp处截短，形成所述的截短的Pgpd启动子。3.一种高产麦考酚酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括：由MpaB基因和pPK2质粒形成重组质粒pPKCMH，由经过截短的Pgpd启动子启动MpaB基因的表达，所述的重组质粒pPKCMH经根癌农杆菌GV3101介导转移至短密青霉中，形成高产麦考酚酸的基因工程菌。4.根据权利要求3所述的构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏巍，陈绵辉，魏东芝，熊志，陈继敏，
申请(专利权)人：广东蓝宝制药有限公司，
类型：发明
国别省市：