一种朱顶红SRAP-PCR反应体系及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种朱顶红SRAP‑PCR反应体系及其应用，该反应体系包括1×PCR Buffer，1.5～2.0mmol/L Mg2+，0.1～0.3mmol/L dNTPs，0.25～0.5μmol/L引物，40～80ng/20μL DNA模板，0.5～2.0U/20μL Taq DNA聚合酶；所述DNA模板为朱顶红基因组DNA。本发明专利技术用10个朱顶红品种基因组DNA对该反应体系进行验证，试验结果证明本发明专利技术的反应体系具有较高的稳定性和重复性，能够为朱顶红品种遗传多样性研究和标准指纹图谱数据库的建立提供重要技术支持，可应用于朱顶红品种的快速鉴别、亲缘关系分析、杂交子代的早期鉴定、新品种登录、分子标记辅助育种等方面。

A Hippeastrum SRAP-PCR reaction system and its application

The invention discloses a PCR reaction system Amaryllis red SRAP and its application, the reaction system including 1 * PCR Buffer, 1.5 ~ 2.0mmol/L Mg2+, 0.1 ~ 0.3mmol/L dNTPs, 0.25 ~ 0.5 mol/L primers, 40 ~ 80ng/20 L DNA template, 0.5 ~ 2.0U/20 L Taq DNA polymerase the template for DNA; Hippeastrum genomic DNA. The present invention is carried out to verify the reaction system with 10 hippeastrumvittatum genomic DNA, the test results show that the stability of the reaction system of the present invention has high and repeatability, which can provide important technical support for the establishment of genetic diversity of hippeastrumvittatum and standard fingerprint database, can be used for rapid identification, hippeastrumvittatum phylogenetic analysis of the hybrids, early identification and new variety registration and molecular marker assisted breeding etc..

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学标记
，具体涉及一种朱顶红SRAP-PCR反应体系及其应用。
技术介绍
朱顶红(Hippeastrumspp.)为石蒜科朱顶红属(Hippeastrum)球根花卉的总称，原产于中南美洲。花卉市场上常见的朱顶红绝大多数为园艺杂交种或品种。由于朱顶红品种繁多、花色丰富、株形优美，作为切花和盆花都具有较高的观赏价值，在国际和国内花卉市场上均深受喜爱，具有极高的开发前景。我国生产中大量应用的优质朱顶红种质资源主要引自荷兰。目前进口的种球价格为30-50元/个。只有实现朱顶红种球生产国产化，才有可能降低种球成本，推动朱顶红产业的健康发展。相对来说，我国的朱顶红研究工作还处于起步阶段，主要集中在栽培和扩繁技术、杂交育种、花期控制等方面。目前已引入国内的朱顶红品种呈现出遗传多样性高且亲缘关系不清的局面，采用传统分类学方法很难区分其种下类群及品种。张林等(2012)对62个朱顶红品种进行了遗传关系分析并构建了ISSR指纹图谱。相关序列扩增多态性(sequence-relatedamplifiedpolymorphism,SRAP)是一种基于PCR扩增的标记系统。与其他标记相比，SRAP标记具有操作简单、多态性高、重复性好、适用性强等优点，SRAP分子标记具有操作简便、引物通用、PCR反应程序较为通用、无需基因组或转录组信息、多态性高等突出优点，特别适宜应用于遗传多样性高但遗传背景不十分清晰的观赏植物研究。但SRAP分子标记受PCR反应体系和物种水平影响较大。SRAP分子标记方法已在观赏植物遗传多样性和遗传图谱构建研究中得到较为广泛的应用，例如在石蒜、牡丹、菊花、春兰、万寿菊中有相关报道。但关于朱顶红属植物SRAP分子标记的研究还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种朱顶红SRAP-PCR反应体系及其应用，建立朱顶红属植物SRAP分子标记检测方法中SRAP-PCR反应体系，可应用于朱顶红品种的快速鉴别、亲缘关系分析、杂交子代的早期鉴定、新品种登录、分子标记辅助育种等方面。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是：一种朱顶红SRAP-PCR反应体系，其SRAP-PCR反应体系包括：1×PCRBuffer，1.5～2.0mmol/LMg2+，0.1～0.3mmol/LdNTPs，0.25～0.5μmol/L引物，40～80ng/20μLDNA模板，TaqDNA聚合酶0.5～2.0U/20μL；所述DNA模板为朱顶红基因组DNA。优选的，所述SRAP-PCR反应体系中Mg2+浓度为1.75～2.0mmol/L。优选的，所述SRAP-PCR反应体系包括：1×PCRBuffer，2.0mmol/LMg2+，0.2mmol/LdNTPs，0.25μmol/L引物，80ng/20μLDNA模板，TaqDNA聚合酶用量0.5U。优选的，所述SRAP-PCR的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，37℃复性1min，72℃延伸1min，5个循环反应；再，94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环反应；72℃延伸10min。本专利技术以朱顶红品种基因组DNA为模板，采用正交试验设计的方法，研究了SRAP-PCR反应体系中5种因素(Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、DNA模板量和TaqDNA聚合酶用量)对扩增的影响，通过优化获得朱顶红SRAP-PCR反应体系，并对优化后的SRAP-PCR体系进行稳定性验证。本专利技术所述朱顶红SRAP-PCR反应体系可应用于朱顶红品种亲缘关系分析、朱顶红品种快速鉴别、朱顶红杂交子代早期鉴定、朱顶红品种标准指纹图谱建立和朱顶红分子标记辅助育种。本专利技术建立了朱顶红属植物的SRAP-PCR体系，能够为朱顶红品种遗传多样性研究和标准指纹图谱数据库的建立提供重要技术支持，可应用于朱顶红品种的快速鉴别、亲缘关系分析、杂交子代的早期鉴定、新品种登录、分子标记辅助育种等方面。本专利技术的有益效果：本专利技术在L16(45)正交设计基础之上，通过评分并结合统计分析，综合有效性和经济性，成功建立了朱顶红SRAP-PCR反应体系：1×PCRBuffer，1.5～2.0mmol/L的Mg2+，0.1～0.3mmol/LdNTPs，0.25～0.5μmol/L引物，40～80ng/20μLDNA模板，TaqDNA聚合酶0.5～2.0U/20μL。本专利技术所述SRAP-PCR反应体系具有很高的通用性和稳定性，可应用于朱顶红遗传多样性分析、遗传图谱构建、杂种早期鉴定等方面。附图说明图1为本专利技术实施例1中朱顶红品种‘4771’作为模板的SRAP-PCR正交试验结果，其中，M代表MarkerDL2000，1-16代表表1中1-16号反应体系；图2为本专利技术实施例1中朱顶红品种‘4960’作为模板的SRAP-PCR正交试验结果，其中，M代表MarkerDL2000，1-16代表表1中1-16号反应体系；图3为本专利技术实施例2中Mg2+浓度与平均值(k)的关系图；图4为本专利技术实施例2中dNTPs浓度与平均值(k)的关系图；图5为本专利技术实施例2中引物浓度与平均值(k)的关系图；图6为本专利技术实施例2中DNA模板量与平均值(k)的关系图；图7为本专利技术实施例2中TaqDNA聚合酶用量与平均值(k)的关系图；图8为本专利技术实施例3中10个朱顶红品种基因组DNA的SRAP-PCR扩增图谱，其中，M代表MarkerDL2000，1-10扩增引物组合为Me4/Em1，11-20扩增引物组合为Me4/Em2，21-30扩增引物组合为Me4/Em3，31-40扩增引物组合为Me4/Em4，41-50扩增引物组合为Me4/Em5。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明。实施例1材料与方法1)供试材料与试剂试验材料为种植于上海农业科学院林果所花卉试验苗圃的朱顶红品种‘小星星’(编号‘4771’)和‘旋转木马’(编号‘4960’)。取生长健壮植株的新叶作为基因组DNA提取材料，存于-20℃冰箱备用。试验使用的TaqDNA聚合酶、dNTPs以及2000bpDNAmarker购自TaKaRa公司，用于SRAP反应的引物购自上海生物工程技术服务有限公司，以预试验为基础，使用Me3(TGAGTCCAAACCGGAAT)和Em10(GACTGCGTA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种朱顶红SRAP‑PCR反应体系，所述SRAP‑PCR反应体系包括：1×PCR Buffer，1.5～2.0mmol/L Mg2+，0.1～0.3mmol/L dNTPs，0.25～0.5μmol/L引物，40～80ng/20μL DNA模板，Taq DNA聚合酶用量0.5～2.0U/20μL；所述DNA模板为朱顶红基因组DNA。

【技术特征摘要】
1.一种朱顶红SRAP-PCR反应体系，所述SRAP-PCR反应体系包括：
1×PCRBuffer，1.5～2.0mmol/LMg2+，0.1～0.3mmol/LdNTPs，0.25～0.5
μmol/L引物，40～80ng/20μLDNA模板，TaqDNA聚合酶用量
0.5～2.0U/20μL；所述DNA模板为朱顶红基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的朱顶红SRAP-PCR反应体系，其特征在于，所
述SRAP-PCR反应体系中Mg2+浓度为1.75～2.0mmol/L。
3.根据权利要求1-2任一项所述的朱顶红SRAP-PCR反应体系，其特征
在于，所述SRAP-PCR反应体系包括：1×PCRBuffer，2.0mmol/LMg2+，
0.2mmol/LdNTPs，0.25μmol/L引物，80ng/20μLDNA模板，TaqDNA
聚合酶0.5U/20μL。
4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙翊，张永春，殷丽青，杨柳燕，李心，费如桂，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31