本发明专利技术公开了一种用流式细胞术进行小麦根尖细胞的G1期，S期，G2/M期分析的方法，属于生物技术领域。该方法包括小麦种子浸种催芽，切取小麦根尖样品，样品经卡诺氏固定液固定；磷酸缓冲液漂洗干净；置于纤维素酶和果胶酶混合酶液中酶解1‑2 h；漂洗干净后通过研磨制成单细胞悬液；漂洗后用DAPI染液对根尖细胞避光染色10 min；漂洗过滤后通过流式细胞仪将不同DNA含量的周期时相，包括G1期，S期，G2/M期细胞进行区分和计数，了解细胞的增殖情况。该方法具有简单易于操作，分离材料易于得到，酶解方法简单，获得单细胞悬液纯度高，流式细胞仪检测效果好，结果稳定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术得到国家自然基金青年项目（31501234）的资助。
本专利技术属于生物
，涉及用流式细胞术进行小麦根尖细胞周期（G1期，S期，G2/M期）的分析方法。
技术介绍
流式细胞仪（FlowCytometer，FCM）是以激光技术、光电测量技术、计算机技术、流动力学技术、电子物理、细胞免疫荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。它可以在单细胞水平上进行定性、定量分析及分选，主要应用于血液学、免疫学、肿瘤学、分子生物学和细胞生物学等学科的基础研究及临床试验中。相对于动物和微生物而言，由于植物组织与细胞结构复杂（如细胞壁、特殊细胞器等），制备适合流式细胞仪分析的单细胞悬浮液比较困难，流式细胞仪在在植物学领域的应用相对比较滞后。但随着流式样品制备技术的不断更新，流式细胞术在植物科学领域如植物遗传育种、植物染色体分析与文库构建、逆境植物学、植物分类学、植物病理学等各个学科中显示出广阔的应用前景。
用流式细胞仪检测样本时，要求样本必须是完整的细胞或细胞核的悬浮液。并且细胞核的浓度也要达到一定的要求。由于植物细胞具有细胞壁外，并且含有大量次生代谢物，这就给制备样本增加了难度，大大降低了流式实验的成功率。而且不同的植物结构和成分有较大的差异，所以在制备细胞核悬浮液上方法不同，通常所用的的细胞核制备方法有直接剪切法和酶解法。目前在植物学研究中，主要通过制备植物单细胞核悬液进行流式细胞分析，从而检测植物细胞核DNA含量及染色体倍性。尽管已在玉米、甘薯、猕猴桃、小麦等植物上利用流式细胞术进行了细胞核DNA含量的研究，但这些研究均是用不同解离液提取这些植物不同组织细胞的细胞核时，杂质和样品碎片较多，易与细胞核聚成团，并且非离子去垢剂的浓度难以把握，破坏细胞膜的同时也易破坏核膜，这样就造成提取的细胞核数目少。
植物生长在自然环境中,必然受到各种外界环境的刺激作用，植物响应外界环境的变化一直是生物学关心的课题。植物的生长发育就是植物细胞的生长和分裂，而植物细胞周期的变化与其生长发育密切相关。小麦作为重要的粮食作物之一，研究小麦的细胞周期，具有非常重要的现实意义。已有研究表明，和动物细胞一样，植物细胞存在复杂的细胞周期调控机理，从而影响植物的生长发育本研究在前人研究的基础上，通过改进制备出完整的、形态较好、不粘连的小麦单细胞，再利用荧光染料DAPI对小麦根尖细胞进行核酸染色，根据核酸结合量确定细胞周期，使用流式细胞仪将不同DNA含量的周期时相，如G1期，S期，G2/M期，加以区分和计数，了解细胞的增殖情况，为进一步做分子生物学研究奠定基础。本方法建立了完整可行的试验方法，操作步骤简单，试验效果稳定、清晰，因此无论是在科研、检测以及学生试验中都能得到很好的应用。
技术实现思路
本专利技术以小麦根尖作为实验材料制备单细胞悬液，再利用流式细胞仪检测其细胞周期变化，意义在于为进一步研究小麦生长发育及小麦响应环境变化效应的分子机制提供技术支撑。
为实现上述目的，本专利技术公开如下技术方案如下：
1、一种适用流式细胞术进行小麦根尖细胞周期分析的方法，它是利用固定好的小麦根尖样品，制备小麦根尖组织的单细胞悬浮液，进行荧光染色，流式细胞仪检测，包括：
（1）小麦种子进行浸种催芽，待根长长至3-5cm时，切取约0.2cm长度的根尖，固定于新鲜配制的卡诺氏固定液中30min，用pH7-8的磷酸缓冲液漂洗干净后再转入体积比为70％的乙醇中，保存于4℃冰箱；所述的卡诺氏固定液指的是：甲醇:冰乙酸的体积比为3:l；其特征在于：
（2）将固定好的根尖样品置入0.1－0.2％（v/v）的甘油中渗透2-3h，用pH7-8的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10min，静置沉淀后用移液枪吸取上层缓冲液，再浸没于纤维素酶和果胶酶制成的混合酶液中，37℃酶解1.5-3h，使小麦根尖组织松软；所述的纤维素酶和果胶酶的质量浓度皆为2%，用去离子水配制；
（3）将所述步骤2）中的小麦根尖用pH7-8的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10min，用移液枪吸取大部分上层缓冲液后，用研棒温和研磨成单细胞悬液，过滤，收集滤液，即可获得单细胞悬液.目前，在植物上通常是提取植物组织细胞的细胞核，提取液成分复杂，杂质和碎片易于细胞核聚集成团，难于分离，本专利技术用常规试剂制成的单细胞悬液杂质碎片少，更易于后续实验操作。
（4）单细胞悬液经3000r.p.m.离心4min，获取的沉淀加入浓度为0.5-2μg/ml的4，6-联脒-2-苯基吲哚染液，摇匀后避光染色10min，细胞内DNA物质被荧光染色，用pH7-8的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10min；
（5）染色后单细胞悬液用流式细胞仪进行检测，激发光波长为340nm。
本专利技术所述步骤（1）中所述小麦种子用自来水进行浸种催芽，25℃孵育4-5d，待根长长至3-5cm。所述步骤（1）-（5）中用pH7-8的磷酸缓冲液每次漂洗后，均用3000r.p.m.转速离心4min。
本专利技术进一步公开了适用流式细胞术进行小麦根尖细胞周期分析的方法，可在了解细胞的增殖情况方面的进行应用。其中的染色，根据核酸结合量确定细胞周期，将不同DNA含量的周期时相，如G1期，S期，G2/M期，加以区分和计数，了解细胞的增殖情况。本专利技术通过改进制备出完整的、形态较好、不粘连的小麦单细胞，利用荧光染料DAPI对小麦根尖细胞进行核酸染色，根据核酸结合量确定细胞周期，使用流式细胞仪将不同DNA含量的周期时相，如G1期，S期，G2/M期，加以区分和计数，了解细胞的增殖情况，实验结果证明：小麦根尖细胞周期的流式结果图清晰的观察到G1期，S期，G2/M。其中G1期指从有丝分裂完成到DNA复制之前的间隙时间，DNA含量是最少的，即流式检测结果的第一个峰；S期指DNA复制的时期，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示时期跨度比较大，即第二个不高但很宽的峰；G2期指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间，细胞内含二倍DNA，是流式结果图中的第二个峰，故表示为G2/M。
本专利技术公开的适用流式细胞术进行小麦根尖细胞周期分析的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：1）本专利技术方法操作简单，快速简便可行，所用试剂皆为实验室常用试剂；2）制备的单细胞悬液纯度高，杂质碎片少；3）在荧光染色前，单细胞用甘油作为渗透溶剂，使得后续染色效率更高，效果更好；4）样品在流式细胞仪上的检出率高且稳定。5）应用范围广。本专利技术适用于各种品种小麦的根、叶等组织。本专利技术方法和结果为开展与小麦生殖生长相关研究可提供新的途径和依据。
附图说明
图1为南农9918小麦根尖细胞进行流式细胞仪检测的图谱；其中纵坐标NomalizedFrequency表示计数到的有效细胞数所占的频率；横坐标Intensity_MC_Ch07表示荧光强度，即DNA量；R2,R3,R4分别表示G1期,G2期,S期；
图2为京东8号小麦根尖细胞进行流式细胞仪检测的图谱；其中纵坐标NomalizedFrequency表示计数到的有效细胞数所占的频率；横坐标Intensity_MC_Ch07表示荧光强度，即DNA量；R2,R3,R4分别表示G1期,G2期,S期；
图3为适本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适用流式细胞术进行小麦根尖细胞周期分析的方法，它是利用固定好的小麦根尖样品，制备小麦根尖组织的单细胞悬浮液，进行荧光染色，流式细胞仪检测，包括：（1）小麦种子进行浸种催芽，待根长长至3‑5 cm时，切取约0.2 cm长度的根尖，固定于新鲜配制的卡诺氏固定液中30 min，用pH 7‑8的磷酸缓冲液漂洗干净后再转入体积比为70％的乙醇中，保存于4℃冰箱；所述的卡诺氏固定液指的是：甲醇:冰乙酸的体积比为3:l；其特征在于：（2）将固定好的根尖样品置入0.1－0.2％（v/v）的甘油中渗透2‑3h，用pH 7‑8的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10 min，静置沉淀后用移液枪吸取上层缓冲液，再浸没于纤维素酶和果胶酶制成的混合酶液中，37 ℃酶解1.5‑3 h，使小麦根尖组织松软；所述的纤维素酶和果胶酶的质量浓度皆为2%，用去离子水配制；（3）将所述步骤2）中的小麦根尖用pH 7‑8的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10 min，用移液枪吸取大部分上层缓冲液后，用研棒温和研磨成单细胞悬液，过滤，收集滤液，即可获得单细胞悬液；（4）单细胞悬液经3000 r.p.m.离心4 min，获取的沉淀加入浓度为0.5‑2 μg/ml 的4，6‑联脒‑2‑苯基吲哚染液，摇匀后避光染色10 min，细胞内DNA物质被荧光染色，用pH 7‑8的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10 min；（5）染色后单细胞悬液用流式细胞仪进行检测，激发光波长为340 nm。...
【技术特征摘要】
1.一种适用流式细胞术进行小麦根尖细胞周期分析的方法，它是利用固定好的小麦根尖样品，制备小麦根尖组织的单细胞悬浮液，进行荧光染色，流式细胞仪检测，包括：
（1）小麦种子进行浸种催芽，待根长长至3-5cm时，切取约0.2cm长度的根尖，固定于新鲜配制的卡诺氏固定液中30min，用pH7-8的磷酸缓冲液漂洗干净后再转入体积比为70％的乙醇中，保存于4℃冰箱；所述的卡诺氏固定液指的是：甲醇:冰乙酸的体积比为3:l；其特征在于：
（2）将固定好的根尖样品置入0.1－0.2％（v/v）的甘油中渗透2-3h，用pH7-8的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10min，静置沉淀后用移液枪吸取上层缓冲液，再浸没于纤维素酶和果胶酶制成的混合酶液中，37℃酶解1.5-3h，使小麦根尖组织松软；所述的纤维素酶和果胶酶的质量浓度皆为2%，用去离子水配制；
（3）将所述步骤2）中的小麦根尖用pH7-8的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10m...
【专利技术属性】
技术研发人员：岳洁瑜，王利，谈论语，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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