一种磁性纳米材料及其制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及到糖基化蛋白样品的预处理过程。具体来讲就是一种用于糖基化蛋白样品预处理的新型磁性纳米材料。该方法基于磁性纳米材料的制备，后续糖肽树枝状大分子的修饰，以及利用亲水作用色谱对糖基化多肽的富集作用。所述的方法灵敏度高，适用于生物样品中糖基化蛋白的预处理。

【技术实现步骤摘要】
一种磁性纳米材料及其制备与应用
本专利技术涉及新型磁性纳米材料的合成以及糖基化蛋白的样品预处理，具体地说是一种用于糖基化蛋白质快速样品预处理的磁性纳米材料，该磁性材料可用于糖基化多肽的富集。
技术介绍
蛋白质的翻译后修饰(PTMs)是近年来蛋白质组学研究的热点。蛋白质糖基化修饰是最常见，也是最重要的蛋白质翻译后修饰方式之一。它在很多重要的生命活动过程中起着关键的调节作用，如蛋白质折叠，细胞间相互作用，分子识别、免疫应答和炎症反应等。此外，异常的蛋白质糖基化修饰还是癌症及其他一些疾病发生发展的重要标志。许多疾病的诊断标记物及治疗的靶标都来自于糖基化蛋白。因此，研究蛋白质的糖基化修饰对于疾病的诊断以及治疗具有重要的意义。目前，糖基化蛋白以及糖基化位点的研究主要依赖于质谱分析技术(MS)。然而，由于生物样品的复杂程度较高，其中糖基化蛋白的丰度较低，因此，酶解后糖基化多肽的质谱信号就会受到非糖基化多肽的干扰抑制。所以，在质谱鉴定之前，将糖基化多肽从生物样品中选择性地高效地富集出来是非常重要的样品预处理过程。当前，糖基化多肽的富集方法主要有凝集素法、肼化学反应法、硼酸亲和色谱法和亲水相互作用色谱法。其中，一种凝集素只能选择性地富集某一种糖型的糖基化多肽；肼化学法操作繁琐，破坏了糖结构；硼酸亲和色谱法则由于亲和作用比较弱，限制了其在微量生物样品中的应用。亲水相互作用色谱法利用材料和糖结构的亲水相互作用实验对糖基化肽段的富集。并且该方法操作简单，不会破坏糖结构。虽然，大量的亲水材料被用于糖肽的富集，但是亲水材料的富集灵敏度和特异性仍需要提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于微量糖基化蛋白预处理的磁性纳米材料。为实现上述目的，申请人在了解了亲水相互作用色谱法预处理糖基化蛋白质样品原理的基础上，合成了具有易分离、高亲水、多作用位点的磁性纳米材料。本专利技术提供的磁性纳米材料结构为在磁性纳米粒子的表面包覆有一层硅层，利用硅层易于修饰的特点，对磁性纳米颗粒进行了叠氮基多肽树枝状大分子的修饰，然后再“叠氮-叁键”的点击化学修饰上了麦芽糖。所述磁性纳米粒子为Fe3O4，粒径为175-200nm；所述硅层为SiO2，厚度为10-25nm；所述叠氮基多肽树枝状大分子的修饰量为125-145μmol/g磁性纳米颗粒；所述麦芽糖的修饰量为75-95μmol/g磁性纳米颗粒。该磁性材料具有亲水特性，且具有多作用化位点。本专利技术合成用于糖基化蛋白样品富集的磁性纳米材料所采用的技术方案主要包括以下步骤：1)将Fe3O4颗粒分散到稀盐酸中，超声处理，然后用去离子水洗涤至中性，分散到乙醇、水和的浓氨水的混合液中，搅拌，滴加四乙氧基硅烷(TEOS)，反应后分离磁性材料，得到Fe3O4@SiO2纳米颗粒；2)取上述Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散到异丙醇中，在N2保护下滴加氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，反应后分离磁性材料，得到Fe3O4@SiO2-NH2磁性材料；3)取叠氮基多肽树枝状大分子(N3-pepDendrimer：[(azidoacetyl-Tyr)2-Lys-Glu]2-Lys，杭州中肽生化有限公司，产品编号：876430)分散到PBS缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行反应；然后将分散有Fe3O4@SiO2-NH2磁性材料的PBS缓冲液加入到产物溶液中，形成反应混合液，继续进行反应，反应过程中分次加入EDC和NHS；反应结束后，分离磁性材料，得到MNPs-dN3纳米颗粒；4)取上述MNPs-dN3纳米颗粒分散到含有麦芽糖的甲醇水溶液中，加入亚铜催化剂，搅拌反应；分离磁性颗粒，得到dM-MNPs。其中步骤一种所用Fe3O4颗粒的合成方法为将三氯化铁(FeCl3·6H2O)溶于乙二醇中，三氯化铁的浓度为13-14g/L；加入无水醋酸钠(CH3COONa),无水醋酸钠的浓度为35.5-36.5g/L；将得的溶液加热到198-202℃反应7.5-8.5h，分离固体产物，即过滤，用乙醇或去离子水中的一种或二种洗涤，真空干燥，得到Fe3O4颗粒。步骤1)中，稀盐酸的浓度为0.09-0.11M，Fe3O4颗粒的浓度为0.95-1.05g/L，超声处理的时间为25-30min，所述浓氨水的质量浓度为25-28％，混合液中乙醇、水和浓氨水的体积比例为75-85:15-20：0.75-1.25，搅拌时间为25-30min，加入的四乙氧基硅烷(TEOS)与浓氨水的体积比例为0.9:1-1:1.1，反应温度为室温，反应时间为7.5-8.5h，分离磁性材料方法为利用磁铁分离后，用无水乙醇洗涤、真空干燥。步骤2)中Fe3O4@SiO2纳米颗粒在异丙醇中的浓度为3-4g/L，Fe3O4@SiO2纳米颗粒在异丙醇中分散后需超声处理25-30min，滴加的氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的终浓度为75-125g/L；反应温度为室温，反应时间为23.5-24h，分离磁性材料方法为利用磁铁分离后，用异丙醇、无水乙醇或水中的一种或二种或三种洗涤，真空干燥。步骤3)中所述PBS缓冲液pH为5-6，N3-pepDendrimer在PBS缓冲液中的浓度为0.45-0.55mg/mL；加入的EDC与N3-pepDendrimer的质量比例为4.5:1-5.5:1，NHS与N3-pepDendrimer的质量比例为4.5:1-5.5:1；机械搅拌下反应，反应温度为室温，反应时间为25-30min；Fe3O4@SiO2-NH2磁性材料在PBS缓冲液中的浓度为4.5-5.5g/L；反应混合液中Fe3O4@SiO2-NH2与原始加入的N3-pepDendrimer的质量比例为4.5:1-5.5:1；继续反应的温度为室温，时间为47.5-48h；设反应时间为s，继续反应过程中，所述分次加入指在反应时间内，每过s/N时间加入一次EDC和NHS，每次加入的EDC量相等，每次加入的NHS量相等，共加入N次；N次加入的EDC总量与向N3-pepDendrimer的PBS缓冲溶液中加入的EDC量相等，加入的NHS总量与向N3-pepDendrimer的PBS缓冲溶液中加入的NHS量相等；分离磁性材料的方法为利用磁铁分离，用PBS缓冲液、无水乙醇或水中的一种或二种或三种洗涤，真空干燥；N为不小于4且不大于7的正整数。步骤4)中所述麦芽糖为1-炔丙基-O-麦芽糖，甲醇水溶液中1-炔丙基-O-麦芽糖的浓度为6-7g/L，甲醇的体积浓度为45-55％；MNPs-dN3纳米颗粒分散到上述溶液中后的浓度为2.5-3.5g/L；所述亚铜催化剂为含CuSO416-16.5mg/mL、抗坏血酸35-35.5mg/mL的水溶液；反应温度为室温，反应时间为11.5-12h；所述分离磁性颗粒的方法为利用磁铁分离，用甲醇、乙醇或水的一种或二种或三种洗涤，真空干燥。本专利技术提供的磁性纳米材料可以用于对糖基化多肽进行选择性富集。本专利技术由于采用以上技术方案，其合成的材料具有以下优点：1)易分离，由于磁核的存在，利用磁铁可以在几十秒内实验材料与富集体系的分离；2)亲水性高，由于硅层，树枝状大分子和麦芽糖的存在，材料的亲水性较好；3)适合于微量样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种磁性纳米材料，其特征在于：结构为在磁性纳米粒子的表面包覆有一层硅层，利用硅层易于修饰的特点，对磁性纳米颗粒进行了叠氮基多肽树枝状大分子的修饰，然后再“叠氮‑叁键”的点击化学修饰上了麦芽糖。

【技术特征摘要】
1.一种磁性纳米材料，其特征在于：结构为在磁性纳米粒子的表面包覆有一层硅层，利用硅层易于修饰的特点，对磁性纳米颗粒进行了叠氮基多肽树枝状大分子的修饰，然后再“叠氮-叁键”的点击化学修饰上了麦芽糖,所述的叠氮基多肽树枝状大分子为2.按照权利要求1所述的磁性纳米材料，其特征在于：所述磁性纳米粒子为Fe3O4，粒径为175-200nm；所述硅层为SiO2，厚度为10-25nm；所述叠氮基多肽树枝状大分子的修饰量为125-145μmol/g磁性纳米颗粒；所述麦芽糖的修饰量为75-95μmol/g磁性纳米颗粒。3.按照权利要求1所述的磁性纳米材料，其特征在于：该磁性材料具有亲水特性，且具有多作用化位点。4.一种权利要求1-3任意所述的磁性纳米材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将Fe3O4颗粒分散到稀盐酸中，超声处理，然后用去离子水洗涤至中性，分散到乙醇、水和浓氨水的混合液中，搅拌，滴加四乙氧基硅烷(TEOS)，反应后分离磁性材料，得到Fe3O4@SiO2纳米颗粒；2)取上述Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散到异丙醇中，在N2保护下滴加氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，反应后分离磁性材料，得到Fe3O4@SiO2-NH2磁性材料；3)取叠氮基多肽树枝状大分子N3-pepDendrimer分散到PBS缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行反应；然后将分散有Fe3O4@SiO2-NH2磁性材料的PBS缓冲液加入到产物溶液中，形成反应混合液，继续进行反应，反应过程中分次加入EDC和NHS；反应结束后，分离磁性材料，得到MNPs-dN3纳米颗粒；4)取上述MNPs-dN3纳米颗粒分散到含有麦芽糖的甲醇水溶液中，加入亚铜催化剂，搅拌反应；分离磁性颗粒，得到dM-MNPs。5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：Fe3O4颗粒的合成方法为将三氯化铁(FeCl3·6H2O)溶于乙二醇中，三氯化铁的浓度为13-14g/L；加入无水醋酸钠(CH3COONa),无水醋酸钠的浓度为35.5-36.5g/L；将得到的溶液加热到198-202℃，反应7.5-8.5h，分离固体产物，过滤，用乙醇或去离子水中的一种或二种洗涤，真空干燥，得到Fe3O4颗粒。6.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，稀盐酸的浓度为0.09-0.11M，Fe3O4颗粒的浓度为0.95-1.05g/L，超声处理的时间为25-30min，所述浓氨水的质量浓度为25-28％，混合液中乙醇、水和浓氨水的体积比例为75-85:15-20：0.75-1.25，搅拌时间为25-...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹汉法，李吉楠，王方军，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21