检测IFFO1基因mRNA的可变腺苷酸位点使用情况的引物及方法技术

本发明专利技术公开了检测IFFO1基因mRNA的可变腺苷酸位点使用情况的引物及方法。所述引物包括第一对引物和第二对引物，其序列与IFFO1基因3’非翻译区中的两对序列或其互补序列相同。所述方法包括以下步骤：提取样品总RNA，逆转录得到cDNA；以cDNA为模板，使用第一对引物qPCR扩增common区域的Proximal片段，得到CT值pro；以cDNA为模板，使用第二对引物扩增Extended区域的Distal片段，得到CT值dis；计算CT值dis与CT值pro的比值。本发明专利技术IFFO1基因mRNA的可变腺苷酸位点使用情况的检测方法方便快捷，适合在条件简陋的实验室以及发展中国家得到进一步推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及病毒检测
，尤其设及检测IFF01基因 mRNA的可变腺巧酸位点 使用情况的引物及方法。
技术介绍
马立克氏病（Marek's disease,MD)是由马立克氏病病毒（（Marek's disease virus，MDV)引起的一种禽类高度接触性、传染性、淋己组织增生性肿瘤病，主要危害鸡，鹤 譜、山鸡也有发病。该病可引起内脏器官、肌肉和外周神经的淋己细胞瘤的神经肿大。临床 上MD发病鸡群表现为生长不均匀、极度消瘦、死亡等症状，最常见的病变是神经损害和多种 实质脏器的淋己肿瘤，W肝脏、脾脏肿瘤最为多见，因神经损害导致的不对称性进行性麻 搏，最终可引起单个或多个肢体的完全性麻搏。 MDV属于瘤疹病毒科，有Ξ种不同血清型，不同血清型毒株既含有共同抗原，也含 有特异性抗原。I型MDV感染能引起肿瘤，Π 型和虹型MDV毒株无致病性，可用于疫苗株。因 I 型MDV感染可引起肿瘤，其检测具有非常重要的意义。目前，临床上最常用鉴别诊断I型MDV 感染的方法是病毒分离培养、血清学检测、分子生物学方法等。病毒分离鉴定不但对临床诊 断很有价值，对流行病学及病原学研究亦至关重要，但该方法检测周期长，约需1~2个月， 同时细胞培养的操作要求高，局限性较大。血清学方法如化ISA等主要用于检测羽毛囊上 皮、溶细胞感染的淋己细胞组织及细胞培养物等样品，此类方法检测成本相对较高，并且由 于部分病例中病毒血症时间较短，病毒含量低，导致检出率较低。
技术实现思路
有鉴于此，有必要针对现有技术中检测马立克氏病病毒存在的问题，提供IFF01 (intermediate filament family 0巧ban 1,IFF01)基因 mRNA的可变腺巧酸位点使用情况 的检测引物及检测方法。 为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： -种检测IFF01基因 mRNA的可变腺巧酸位点使用情况的引物，所述引物包括第一 对引物和第二对引物，其序列与IFF01基因3'非翻译区中的两对序列或其互补序列相同。 优选地，所述第一对引物的序列与IFF01基因 3'非翻译区中common区域的部分序 列或其互补序列相同，所述第二对引物的序列与IFF01基因 3'非翻译区中Extended区域的 部分序列或其互补序列相同。[000引优选地，所述第一对引物用于扩增common区域的Proximal片段，所述第二对引物 用于扩增Extended区域的Distal片段。 优选地，所述第一对引物的序列如SEQ ID N0:l-2所示或其互补序列，所述第二对 引物的序列如SEQ ID NO:3-4所示或其互补序列。 -种检测IFF01基因 mRNA的可变腺巧酸位点使用情况的方法，包括W下步骤： 提取样品总RNA，逆转录得到cDNA; WcDNA为模板，使用第一对引物qPCR扩增common区域的Proximal片段，得到CT 值口〇 ; WcDNA为模板，使用第二对引物扩增Extended区域的Distal片段，得到CT值dis; 计算CT值dis与CT值口。的比值。 优选地，所述qPCR的反应体系为： cDNA 模板 I wL， 2xqPCR Master Mix 邸1一.， 上游引物 化巧止， 下游引物 0.2^L， 无核酸酶水 全10}儿。 优选地，所述qPCR的反应条件为： 预变性:95°Clmin;扩增：95°C5s，62°C15s，72°C10s信号收集，40个循环；溶解曲 线：95°Clmin;冷却：37°Clmin。 3 '端非翻译区（3 ' UTR)作为mRNA结构的一部分，对mRNA的稳定性、定位及翻译效率 都起着重要的作用。基因最后一个外显子上的可选择性poly(A)位点，可W导致不同长度的 3 ' UTR，即tandem 3 ' UTR(串联3 ' UTR)。目前已有大量文献报道在免疫应答、神经活化、肿瘤 形成及胚胎发育过程中均有3'UTR长度的改变。在基因动态的调节过程中，选择性聚腺巧酸 化(alternative polyadenylation,APA)在近年来受到人们的广泛关注。最近的研究表明 有超过一半的人类基因含有APA位点。运些都暗示着APA对于基因功能可能有着重要的调控 作用，也有着巨大的潜力成为新的分子标记物。随着第二代高通量测序技术的发展，研究人 员近年来开发了多种高通量测序文库制备方法来对全基因组APA进行测序和分析。随着APA 研究的深入，APA越发成为新的基因转录与翻译调控的研究热点，目前，已有研究开始将APA 作为肿瘤发生的生物学标记。 IFF01基因是中间丝家族的成员，中间丝蛋白则是细胞骨架和核膜的原始组成部 分。本专利技术利用鸡的IFF01基因3'非翻译区中的两对序列或其互补序列，通过实时巧光定量 PCR方法对鸡只组织或血液中的IFF01基因信使核糖核酸mRNA的可变腺巧酸位点使用情况 进行检测，发现宿主在感染MDV后IFF01基因可变腺巧酸位点的使用情况发生了明显改变， 可将IFF01基因可变腺巧酸位点的使用变化作为宿主(鸡只等)感染马立克病毒的生物学标 记。 与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果:本专利技术IFF01基因 mRNA的可变腺巧酸 位点使用情况的检测方法方便快捷，灵敏度高，特异性好，适合在条件简陋的实验室W及发 展中国家得到进一步推广。【附图说明】 图1为mRNA结构中qPCR引物设计位点示意图。 图2为实施例1中IFF01基因 APA的变化情况。【具体实施方式】 为了更好的说明本专利技术，下面结合附图和【具体实施方式】做进一步说明。本专利技术中 所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再寶述。 实施例1 用lXl〇5pfu Md5(Marek's disease virus Md5，MDV Md5)感染单层CEF细胞（鸡 胚成纤维细胞），W不感染的CEF细胞为对照，分别收集1她、36h、54h、72h后的细胞，提取总 RNA ;消化DNA后，检测0D260/280，比值在2.0-2 . 1为合格。对合格的总RNA进行SAPAS (sequence of alternative polyadenylation site,SAPAS)文库的构建，构建好的文库用 化-5日〇-25〇〇平台进行高通量测序，对测序结果进行4?4(日11日111日1:;171日1:;1, APA)的分析。 结果如图2所示，对比感染Md5和不感染Md5的CEF细胞的APA分析结果，发现IFF01 基因多聚腺巧酸化位点的使用情况发生了明显改变，感染Md5的CEF细胞的IFF01基因更偏 向于使用近端的APA位点，可作为感染MDV的一个生物标记。 实施例2 本实施例中检测IFF01基因 mRNA的可变腺巧酸位点使用情况的引物如表1所示。该 引物是根据当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测IFFO1基因mRNA的可变腺苷酸位点使用情况的引物，其特征在于，所述引物包括第一对引物和第二对引物，其序列与IFFO1基因3’非翻译区中的两对序列或其互补序列相同。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹永长，薛春宜，李杰，何亮亮，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44