本发明专利技术公开了一种腺苷脱氨酶检测方法。腺苷脱氢酶的检测试剂由以下两部分组成：试剂1包括磷酸氢二钠8.5‑12mmol/L；4‑氨基安替比林1.5‑2.2mmol/L；嘌呤核苷磷酸化酶2500‑2900U/L；黄嘌呤氧化酶500‑700U/L；过氧化物酶510‑710U/L；抗坏血酸酶1800‑2800U/L；稳定剂适量；辅助因子适量；试剂2包括腺苷10‑14mmol/L；EHSPT 1.5‑2.5mmol/L。本发明专利技术腺苷脱氢酶的检测试剂配方，以及检测参数以及参考区间的确定，有利于临床检测结果的一致化，给临床诊疗带来便利。本发明专利技术方法灵敏度更高，优于常规市售产品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学检验领域，具体涉及一种腺苷脱氨酶检测方法。
技术介绍
腺苷脱氨酶(ADA)是机体必需的核酸分解代谢酶，在临床实验诊断中具有重要价值。目前酶学检测多采用酶偶联原理的连续监测法，测定样本中酶的催化活性浓度，该方法具有简便快速无毒无放射性的优点，在临床中广泛应用。目前临床ADA检测方法虽均采用四步酶偶联的检测原理，但性能参差不齐，且不同厂家的试剂配方及检测过程均存在差异，不同系统间的检测结果差异较大，且没有统一的参考区间，不利于临床检测结果的一致化，给临床诊疗带来诸多困扰。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种腺苷脱氨酶的检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种腺苷脱氢酶的检测试剂，由以下两部分组成：试剂1试剂2腺苷10-14mmol/L；EHSPT1.5-2.5mmol/L。优选的，所述的腺苷脱氢酶检测试剂由以下两部分组成：试剂1试剂2腺苷11-13mmol/L；EHSPT1.8-2.2mmol/L。优选的，所述的腺苷脱氢酶检测试剂由以下两部分组成：试剂1试剂2腺苷12.2mmol/L；EHSPT2.0mmol/L。优选的，试剂1和试剂2均由Tris缓冲液或PBS配制得到。优选的，试剂1和试剂2由Tris缓冲液配制得到，其中Tris缓冲液的浓度为65-95mmol/L，pH6-7。优选的，试剂1和试剂2由Tris缓冲液配制得到，其中Tris缓冲液的浓度为70-90mmol/L，pH6.2-6.8。优选的，试剂1和试剂2由Tris-HCl缓冲液配制得到，其中Tris-HCl缓冲液的浓度为80.0mmol/L，pH6.6。Tris缓冲液包括Tris-HCl和Tris-base。Tris的缓冲体系比PBS缓冲体系效果更佳。最佳的是Tris-HCl缓冲液，其浓度为80.0mmol/L，pH6.6。优选的，稳定剂选自NaN3，其终浓度为0.1-0.3mmol/L。优选的，稳定剂选自NaN3，其终浓度为0.15-0.25mmol/L。优选的，稳定剂选自NaN3，其终浓度为0.2mmol/L。优选的，辅助因子选自TritonX-100，其加入量为试剂1总体积的0.6-0.9％。优选的，辅助因子选自TritonX-100，其加入量为试剂1总体积的0.7-0.8％。优选的，辅助因子选自TritonX-100，其加入量为试剂1总体积的0.76％。辅助因子TritonX-100，也是一种表面活性剂，它可以快速消除非特异性反应，加快反应进程，是整个反应的催化剂。其他的表面活性剂如吐温等无法达到本专利技术的效果。优选的，试剂1中还添加巯基保护剂EDTA，其终浓度为0.15-0.25mmol/L。优选的，试剂1中还添加巯基保护剂EDTA，其终浓度为0.2mmol/L。EDTA可保护被检测的ADA蛋白活性。上述反应中，磷酸氢二钠可提供足够磷酸根，保证反应顺利进行。嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶是反应偶联的工具酶，借助这几个酶的中间反应，使目标酶反应生成的产物经系列反应最终生成利于检测的有色物质。4-氨基安替比林和EHSPT为反应原理中最后一步的呈色反应底物。一种腺苷脱氨酶的检测试剂盒，包括上述任一项所述的试剂。一种腺苷脱氨酶的检测方法，包括下列步骤：1)将180ul试剂1和5ul待测血清样品混合，孵育至37℃；2)加入90ul试剂2进行检测，其中所用试剂如上述任一项所述。优选的，检测波长：550±1nm；延迟时间：120s；监测时间：180s。优选的，检测参考区间基于中国人群建立，其范围为健康成年人0-31U/L。本专利技术检测方法的检测参考区间基于中国人群建立，对中国人群有更好的适应性。优选的，线性范围为0.3-286U/L。本专利技术检测方法具有较宽的线性范围。本专利技术的有益效果是：本专利技术方法在四步酶偶联的检测原理上，对检测条件、检测过程进行研发，优化得到的ADA检测的最佳组合条件。本专利技术腺苷脱氢酶的检测试剂配方，检测参数以及参考区间的确定，有利于临床检测结果的一致化，给临床诊疗带来便利。本专利技术方法灵敏度更高，优于常规市售产品。本专利技术方法检测灵敏度大大提高，并且克服了非特异性反应，检测方法更稳定，快速准确简单，性能得到很大改良，除此外还在该方法基础上建立了基于中国人群的较大样本的参考区间，对于中国人群有更好的适应性。附图说明图1为样本反应全程吸光度扫描图；图2为检测方法的线性范围；图3为参考区间频率分布直方图；图4为优化方法与迈克方法的相关性及相对偏倚。具体实施方式EHSPTN为N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline的简写，中文名乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺。本专利技术的检测原理，如下：其中，ADA：腺苷脱氢酶；PNP：嘌呤核苷磷酸化酶；XOD：为黄嘌呤氧化酶；POD：过氧化物酶。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例11、试剂组成及浓度试剂1：Tris-HCl(80.0mmol/L，pH6.6)，磷酸氢二钠(Na2HPO4，10.3mmol/L)，4-氨基安替比林(4-AA，1.8mmol/L)，嘌呤核苷磷酸化酶(PNP，37℃2760U/L)，黄嘌呤氧化酶(XOD，37℃600U/L)，过氧化物酶(POD，37℃590U/L)，抗坏血酸酶(37℃2306U/L)，NaN3(0.2mmol/L)，TritonX-100(试剂1总体积的0.76％)，EDTA(0.2mmol/L)；试剂2(开始试剂)：Tris-HCl(80.0mmol/L，pH6.6)，腺苷(12.2mmol/L)，EHSPT(2.0mmol/L)。2、检测条件检测温度：37±0.1℃；检测波长：550±1nm；波宽：10mm±0.01mm，光径≤2nm，检测点≥6；孵育时间：300s；延迟时间：120s；监测时间：180s。3、检测样本：血清。4、一种腺苷脱氨酶的检测方法，包括下列步骤：1)180ul试剂1和5ul血清样本加入反应杯，混匀孵育至37℃；部分仪器可以搅拌加温同时进行；如果分步进行，即先混匀，后孵育至37℃，温度达到37℃，约需300s。2)加入90ul试剂2，延迟120s，监测另外180s的线性；其中，可利用生化分析仪自动检测或利用紫外分光光度计进行手工检测。样本反应全程吸光度扫描图见图1。图1说明在样本和反应液孵育阶段，曲线平直(前300秒)说明无非特异性(干扰)反应，加入开始试剂后，反应呈线性。3)计算ADA活性：ADA(U/L)＝F*ΔA/Δt550；换算因子F＝1708[在550nm的ε(次黄苷)＝32.2mmol/cm]。实施例2腺苷脱氨酶检测的性能参数按照实施例1的方法确定本技术的性能参数。结果如下：批内精密度：≤1％，期间精密度：≤2％；线性范围：0.3-286U/L；灵敏度：检测标准物质活性超出给定靶值约30％。抗干扰能力：甘油三酯≤3.39mmol/L(约20倍正常成人水平)，血红蛋白≤3.75g/L(肉眼可见的溶血为300mg/dl)，胆红素＜85.5umol/L，维生素C≤40mg/L(正常人血清维生素C的含量为ng/d本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种腺苷脱氢酶的检测试剂，由以下两部分组成：试剂1磷酸氢二钠 8.5‑12mmol/L；4‑氨基安替比林 1.5‑2.2mmol/L；嘌呤核苷磷酸化酶 2500‑2900U/L；黄嘌呤氧化酶 500‑700U/L；过氧化物酶 510‑710U/L；抗坏血酸酶 1800‑2800U/L；稳定剂 适量；辅助因子 适量；试剂2腺苷 10‑14mmol/L；EHSPT 1.5‑2.5 mmol/L。
【技术特征摘要】
1.一种腺苷脱氢酶的检测试剂，由以下两部分组成：试剂1磷酸氢二钠8.5-12mmol/L；4-氨基安替比林1.5-2.2mmol/L；嘌呤核苷磷酸化酶2500-2900U/L；黄嘌呤氧化酶500-700U/L；过氧化物酶510-710U/L；抗坏血酸酶1800-2800U/L；稳定剂适量；辅助因子适量；试剂2腺苷10-14mmol/L；EHSPT1.5-2.5mmol/L。2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：由以下两部分组成：试剂1磷酸氢二钠9-11mmol/L；4-氨基安替比林1.6-2.0mmol/L；嘌呤核苷磷酸化酶2600-2800U/L；黄嘌呤氧化酶550-650U/L；过氧化物酶560-660U/L；抗坏血酸酶2000-2500U/L；稳定剂适量；辅助因子适量；试剂2腺苷11-13mmol/L；EHSPT1.8-2.2mmol/L。3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：由以下两部分组成：试剂1磷酸氢二钠10.3mmol/L；4-氨基安替比林1.8mmol/L；嘌呤核苷磷酸化酶2760U/L；黄嘌呤氧化酶600U/L；过氧化物酶590U/L；抗...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄宪章，韩丽乔，庄俊华，王建兵，林海标，张乔轩，
申请(专利权)人：广东省中医院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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