本研究拟建立基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的多种奶牛疫病检测方法，解决多种奶牛疫病检测时血清学方法灵敏度低，常规PCR只能针对单一病原体检测，基因芯片方法成本较高等问题，构建3种奶牛疫病RNA阳性样本参考品；以参考品RNA的10倍连续稀释参考品为检测对象，灵敏度为检测至100拷贝；与其他奶牛疫病无交叉反应，无假阴性；检测实际样本600份，满足大量奶牛多种疫病的监控筛查要求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术应用领域，尤其是用于三种进境奶牛病毒病的同时检测与鉴 定。
技术介绍
赤羽病（Akabane Disease，AKA)、牛病毒性腹泻（Bovine Viral Diarrhea，BVD)和 蓝舌病(Bluet〇ngue，BT)是国家规定的进境奶牛需要隔离检疫的3种病毒性疾病。近几年， 随着国民对优质奶制品需求的提升，进境奶牛数量逐年攀升，给奶牛进境口岸动物疫病检 测实验室带来一定的工作压力和经费负担。因此，建立一种可以同时鉴别诊断多种奶牛疫 病的高通量快速检测方法对减轻奶牛进境口岸检测实验室工作负担、降低检测经费及开展 进境奶牛携带疫病的流行病学调查具有重要意义。 目前，针对进境奶牛的多种病毒性疾病，口岸动物检疫实验室普遍应用病毒分离、 血清学方法和分子生物学方法进行检测。病毒分离培养是诊断的金标准，但存在测周期长、 操作繁琐等问题;病毒中和试验需要特异性的标准血清或病毒毒株，在实际应用中具有一 定的局限性;进口的酶联免疫试剂盒普遍价格昂贵;普通PCR、荧光定量PCR等分子生物学方 法皆为针对单一病毒检测，无法满足多种病原混合感染鉴别诊断的检测需求。多重PCR技术 已经应用于多种病原的鉴别诊断，但由于扩增偏爱性问题无法实现真正意义上的高通量检 测 。
技术实现思路
近几年由于进口奶牛数量的逐年增多，承担进境奶牛疫病检测任务的动物检疫工 作人员亟需一种灵敏度高、特异性好的检测方法以满足降低外来动物疫病传入风险和实现 快速通关的工作需求。目前，大多口岸动检实验室所应用的血清学(酶联免疫法)实验，每种 检测试剂盒只能检验单一动物疫病，无法鉴别多种动物疫病的混合感染，并且进口检测试 剂盒昂贵的价格而给检测实验室带来很大的经济压力。因此，建立一种高通量、快速、特异 性好的检测方法对于降低动物疫病传入风险，加速进境动物通关，促进贸易便利化以及降 低动物疫病检测成本均有重要的意义。 GeXP多重基因表达分析系统将多重PCR技术和毛细管电泳技术结合起来，不仅具 有多重PCR扩增高通量检测的优点，而且具有毛细管电泳灵敏性高的特点。GeXP的技术特 点是在特异性引物的5'端加入通用引物序列，组成特异性嵌合引物。在PCR反应过程中，特 异性嵌合引物先分别与对应的模板结合，保证后续扩增的特异性，经过多个循环以后，由通 用引物主导后续的扩增，这样可以减少同一反应体系中不同引物之间的干扰，实现每对引 物扩增效率趋于一致，从而有效解决了常规多重PCR技术的扩增偏爱性问题。 本研究根据3种进境奶牛检疫性病毒的基因保守序列，分别设计了多对特异性引 物和通用引物，优化反应条件，通过对单一病毒模板、混合病毒模板的检测验证了 GeXP多重 RT-PCR体系中每对引物扩增的特异性和准确性，建立了同时检测3种奶牛病毒病的GeXP高 通量方法，检测灵敏度至少可达1〇2拷贝/yL。该方法可为进境奶牛病毒病的分子诊断及境 外奶牛疫病的流行病学调查提供技术支持。今后，还需要大量的阳性样本或病毒毒株对本 方法做进一步的验证和优化。【附图说明】 图1-图4 GeXP多重RT-PCR特异性验证结果（图1，AKAV;图2，BVDV;图3，BTV;图4， 50bp-800bp Marker)，图中Y轴为相对荧光单位，表示扩增产物的荧光强度，X轴为毛细管电 泳过程中扩增产物的大小。 图5-图10 GeXP多重RT-PCR对3种病毒模板的灵敏度结果（图5，106copiesAiL;图 6，10 5copies/yL;图7，lC^copies/yL;图8，103copies/yL;图9，10 2copies/yL;图10，50bp-800bp Marker)〇【具体实施方式】 GeXP启动试剂盒、DNA size standard Kit、分离缓冲液、上样缓冲液购自美国贝 克曼公司，一步法RT-PCR试剂盒、RNA提取试剂盒、基因纯化试剂盒购自德国QIAGEN公司，T7 体外转录试剂盒、Spe I限制性核酸内切酶和RNA酶抑制剂均购自大连宝生物公司，pGEX-T 载体购自Promega公司。 参考文献选择各病毒基因保守区并从GenBank数据库中下载3种病毒的基因序列， 通过DNASTAR软件分析序列同源性，并用GeXP express Profiler工具设计多重特异性引 物。在正、反向特异性引物5'端分别连接一段非同源性序列作为通用引物(Tag)，组成特异 性嵌合引物。引物由Invitrogen公司合成，HPLC纯化。 SEQ ID NOd-AKASJ'-AGGTGACACTATAGAATACACTGCCTTTACGCTCCATC-S' 5'端用 cy5标记； SEQ ID N0：2-AKA4：5/-GTACGACTCACTATAGGGACGGTGCATGTCGATAACCAG-3 /： SEQ ID NOd-BTSJ'-AGGTGACACTATAGAATAGTTCTCTAGTTGACCACCXy 5'端用cy5 标记； SEQ ID N0：4-BT4：5/-GTACGACTCACTATAGGGAAAGCCAGACTGTTTCCCGAT-3 /； SEQ ID NO^-BVDVS^^AGGTGACACTATAGAATA A GCGAA GGCCGAAAA GA GGCTA-37 5'端用cy5标记； SEQ ID N0：6-BVDV4： 57-GTACGACTCACTATAGGGAAACTCCATGTGCCATGTACAGCAG-3 7 ； SEQIDN0:7-通用引物l:5/-AGGTGACACTATAGAATA-3 /5/端用cy5标记； SEQ ID如:8-通用引物2:5/-6丁八06八(：1^八(7^丁八666八-3灭活的八1^￥、8￥0￥、81'毒株 均为本实验室保存。病毒RNA的提取使用QIAGEN公司RNA提取试剂盒，洗脱体积为40yL，于-80°C保存。 以不含通用引物的特异性引物分别扩增含有目的基因区域的病毒RNA，扩增后的 PCR产物连接到pGEX-T载体进行单克隆构建质粒，提取克隆质粒，Spe I酶切线性化，并用基 因纯化试剂盒对线性化后质粒进行纯化，用T7转录试剂盒进行体外转录，利用紫外分光光 度计测量RNA浓度并计算各病毒RNA的拷贝数。 将通用引物稀释至工作浓度ΙΟμ mol/L，特异性引物稀释至工作浓度Ιμπιο?/L。提取 3种病毒RNA作为模板，按照一步法RT-PCR试剂盒配制反应体系：10 X RT-PCR缓冲液2.5yL， dNTP预混液2yL，RT-PCR Enzyme Mix lyL，RNA酶抑制剂O.lyL，上下游嵌合引物（Ιμπιο?/L) 各取lyL，上下游通用引物（ΙΟμ mol/L)各取lyL，模板RNA2yL，用不含核酸酶的水补足25yL。 经过条件优化后，最终确定反应条件为:45°C30min，94°C15min逆转录;然后:94°C30s，55°C 30s，72°C30s，10个循环；94°C30s，65°C30s，72°C30s，10个循环；94°C30s，50°C30s，72°C 30s，20个循环;72°C10min，1个循环。反应产物进行GeXP s本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同时检测赤羽病(Akabane Disease，AKA)、牛病毒性腹泻(Bovine Viral Diarrhea，BVD)、蓝舌病(Bluetongue，BT)的引物组合：其特征在于特异性引物和通用引物序列如SEQ NO：1至8所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王乃福，刘洋，吴冬雪，黄晨，陈小金，王万骞，董志珍，赵祥平，
申请(专利权)人：天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：天津;12
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