一种从皱瘤海鞘中分离黑麦草内酯的方法技术

本发明专利技术公开了一种从皱瘤海鞘中分离黑麦草内酯的方法，先将皱瘤海鞘用乙醇浸提，再进行正相硅胶柱层析，然后采用反向固相萃取分离得到粗品，最后用HPLC进行纯化。本发明专利技术提供的一种从皱瘤海鞘中分离黑麦草内酯的方法，方法简单，提取时间短，效率高，得到的黑麦草内酯纯度高。

【技术实现步骤摘要】
一种从皱瘤海鞘中分离黑麦草内酯的方法
本专利技术属于药物分离工艺领域，具体地说，涉及一种从皱瘤海鞘中分离黑麦草内酯的方法。
技术介绍
海鞘是尾索动物亚门海鞘纲的尾索动物，在自然界中已知有1500余种，主要分布在热带及亚热带海域。我国海鞘资源丰富，已记录的中国沿海海鞘种类有100余种，且有很多为我国所特有。据报道，海鞘中含有多种具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎等活性的化合物，因此，近年来，海鞘的化学成分及其生物活性成为了海洋天然产物研究的热门领域。皱瘤海鞘(Styelaplicata)是海鞘中的一种，主要分布于我国中南沿海，福建、广东和海南等，部分地区也有人工养殖。皱瘤海鞘经常在一些海产养殖过程中一同生长起来，虽然皱瘤海鞘在部分地区有作为食物食用的习惯，但大部分的皱瘤海鞘仍然是作为养殖过程中的副产物被丢弃掉，造成了大量的浪费。因此，如果能将皱瘤海鞘进行有效的利用，不仅具有一定的经济价值，也可以解决浪费问题。黑麦草内酯(Loliolide)的化学结构式如下所示，其分子式为C11H16O3，相对分子量为196.246。经报道，黑麦草内酯具有抗菌、抗肿瘤的生物活性，还可以抑制EB病毒的早期抗原EBV-EA的产生；另有报道其具有一定的免疫抑制作用；此外，黑麦草内酯还可以抑制藻类生长，是一种潜在的水体富营养化控制剂。因此，黑麦草内酯具有一定的研究价值与经济价值。目前，黑麦草内酯的主要来源是从植物中提取分离，而从皱瘤海鞘中提取分离黑麦草内酯的方法还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种从皱瘤海鞘中分离黑麦草内酯的方法，方法简单，提取时间短，效率高，得到的黑麦草内酯纯度高。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种从皱瘤海鞘中分离黑麦草内酯的方法，包括：1)取皱瘤海鞘，用乙醇浸提得到乙醇粗提物；乙醇粗提物用甲醇溶解后过滤，滤液浓缩得到粗提物溶液，按粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:4～8的比例，用100～200目的正相硅胶进行柱层析；以二氯甲烷-甲醇混合液作为洗脱液，且依次按100％二氯甲烷→0.5～1.5％甲醇→8～12％甲醇→45～55％甲醇→100％甲醇进行梯度洗脱，每一梯度洗脱1～7个柱体积，分别收集每个柱体积的洗脱液，浓缩至干，进行TLC分离；所述TLC分离条件为：硅胶G254薄层板，体积比8～12:1的二氯甲烷-甲醇混合液作为展开剂；2)取步骤1)TLC中Rf值为0.45～0.55的组分，合并后进行反相固相萃取分离，采用BondElutC18固相萃取柱，真空固相萃取装置，湿法上样，以甲醇-水混合液作为洗脱液，且依次按100％水→25～35％甲醇→65～75％甲醇→100％甲醇进行梯度洗脱，每一梯度洗脱1～7个柱体积，收集各梯度的洗脱液，得到100％水组分、25～35％甲醇组分、65～75％甲醇组分、100％甲醇组分；3)取步骤2)中得到的25～35％甲醇组分，浓缩至干，得到粗品；4)取步骤3)中得到的粗品，用甲醇配置成0.8～1.2mg/mL，采用HPLC进行纯化；HPLC条件为：固定相：HPLC半制备柱ODS-A，20×250mm，柱内径5μm；流动相：45～55％甲醇；流速：6～10mL/min；进样量：0.95～1.05mL；检测器：检测波长：210nm和220nm；收集22～28min大峰出现时的洗脱液，浓缩，即得黑麦草内酯。一实施例中：所述步骤1)中，粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:5.5～6.5；以二氯甲烷-甲醇混合液作为洗脱液，且依次按100％二氯甲烷→0.8～1.2％甲醇→9.5～10.5％甲醇→49～51％甲醇→100％甲醇进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～6个柱体积，分别收集每个柱体积的洗脱液，浓缩至干，进行TLC分离；所述TLC分离条件为中，展开剂为体积比9～11:1的二氯甲烷-甲醇混合液。一实施例中：所述步骤2)中，取步骤1)TLC中Rf值为0.48～0.52的组分；反相固相萃取分离中，以甲醇-水混合液作为洗脱液，且依次按100％水→29～31％甲醇→69～71％甲醇→100％甲醇进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～6个柱体积，收集各梯度的洗脱液，得到100％水组分、29～31％甲醇组分、69～71％甲醇组分、100％甲醇组分。一实施例中：所述步骤3)中，取步骤2)中得到的29～31％甲醇组分，浓缩至干，得到粗品。一实施例中：所述步骤4)中，取步骤3)中得到的粗品，用甲醇配置成0.9～1.1mg/mL；HPLC条件中：流动相：49～51％甲醇；流速：7～9mL/min；溶液传输单元：LC-6AD；进样器：SIL-10AP；进样量：0.95～1.05mL；检测器：光电二极管阵列检测器SPD-M20A；收集24～26min大峰出现时的洗脱液，浓缩，即得所述之黑麦草内酯。一实施例中：所述步骤1)中，用乙醇浸提得到乙醇粗提物的方法为：取皱瘤海鞘，阴干，切碎，向切碎后皱瘤海鞘中加入1～1.5倍体积的乙醇，置均质机中破碎后，浸提6～8d，浸提液取出备用；重新加入1～1.5倍体积的乙醇，浸提2～4d后，浸提液取出备用；再次加入1～1.5倍体积的乙醇，浸提2～4d后，取出备用；三次得到的的浸提液相互合并，回收溶剂，即得乙醇粗提物。一实施例中：所述浸提过程中，每天超声振动提取0.5～2h。一实施例中：其特征在于：所述步骤1)中，正相硅胶型号为SY01。一实施例中：所述步骤2)中，真空固相萃取装置为12管或24管真空固相萃取装置。一实施例中：所述步骤2)中，所述固相萃取柱为若干根固相萃取柱并联。本技术方案与
技术介绍
相比，它具有如下优点：1.黑麦草内酯的传统来源之一是从植物中提取，但植物提取方法比较繁琐，其中具有叶绿素等色素，还有纤维素等，这些物质干扰性较强且不易除去，且植物细胞具有细胞壁，相对提取效率较低；本专利技术提供了一种从皱瘤海鞘中分离黑麦草内酯的方法，皱瘤海鞘作为一种海洋动物，不具有细胞壁，而且其中的成分较为单纯，含有的氨基酸、糖类的物质也相对容易去除，因此，从皱瘤海鞘中提取黑麦草内酯，比从植物中提取，方法更为简单，且提取效率更高，纯度更高。2.皱瘤海鞘经常在其他海产养殖中一并成长起来，以往都是作为副产物被丢弃掉，造成了大量的浪费，本专利技术提供了从皱瘤海鞘中提取黑麦草内酯的方法，为皱瘤海鞘的再利用提供了思路，可以有效减少了浪费，实现节约资源的目的。3.本专利技术的从皱瘤海鞘中提取黑麦草内酯的方法，采用了反相固相萃取的方式，与传统的分子筛相比，所需时间大大缩短，能够缩短提取时间一倍以上，提取效率更高，而且成本可比分子筛降低至少一倍；与反相液相色谱提取方法相比，能够大大减少提取过程中样品损耗较大的问题。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。图1为本实施例1中得到的黑麦草内酯在流动相为50％甲醇时的HPLC分析谱图。图2为本实施例1中得到的黑麦草内酯的MS谱图。图3为本实施例1中得到的黑麦草内酯的1H谱谱图。图4为本实施例1中得到的黑麦草内酯的13C谱谱图。具体实施方式下面通过实施例具体说明本专利技术的内容：实施例11)取湿重10kg的皱瘤海鞘，阴干，切碎，向切碎后皱瘤海鞘中加入1.25倍体积的乙醇，置均质机中破碎后，置于5L烧杯中，浸提7d且浸提过程中每天超声振动提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从皱瘤海鞘中分离黑麦草内酯的方法，其特征在于：包括：1)取皱瘤海鞘，用乙醇浸提得到乙醇粗提物；乙醇粗提物用甲醇溶解后过滤，滤液浓缩得到粗提物溶液，按粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:4～8的比例，用100～200目的正相硅胶进行柱层析；以二氯甲烷‑甲醇混合液作为洗脱液，且依次按100％二氯甲烷→0.5～1.5％甲醇→8～12％甲醇→45～55％甲醇→100％甲醇进行梯度洗脱，每一梯度洗脱1～7个柱体积，分别收集每个柱体积的洗脱液，浓缩至干，进行TLC分离；所述TLC分离条件为：硅胶G254薄层板，体积比8～12:1的二氯甲烷‑甲醇混合液作为展开剂；2)取步骤1)TLC中Rf值为0.45～0.55的组分，合并后进行反相固相萃取分离，采用Bond Elut C18固相萃取柱，真空固相萃取装置，湿法上样，以甲醇‑水混合液作为洗脱液，且依次按100％水→25～35％甲醇→65～75％甲醇→100％甲醇进行梯度洗脱，每一梯度洗脱1～7个柱体积，收集各梯度的洗脱液，得到100％水组分、25～35％甲醇组分、65～75％甲醇组分、100％甲醇组分；3)取步骤2)中得到的25～35％甲醇组分，浓缩至干，得到粗品；4)取步骤3)中得到的粗品，用甲醇配置成0.8～1.2mg/mL，采用HPLC进行纯化；HPLC条件为：固定相：HPLC半制备柱ODS‑A，20×250mm，柱内径5μm；流动相：45～55％甲醇；流速：6～10mL/min；进样量：0.95～1.05mL；检测器：检测波长：210nm和220nm；收集22～28min大峰出现时的洗脱液，浓缩，即得黑麦草内酯。...

【技术特征摘要】
1.一种从皱瘤海鞘中分离黑麦草内酯的方法，其特征在于：包括：1)取皱瘤海鞘，用乙醇浸提得到乙醇粗提物；乙醇粗提物用甲醇溶解后过滤，滤液浓缩得到粗提物溶液，按粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:4～8的比例，用100～200目的正相硅胶进行柱层析；以二氯甲烷-甲醇混合液作为洗脱液，且依次按100％二氯甲烷→0.5～1.5％甲醇→8～12％甲醇→45～55％甲醇→100％甲醇进行梯度洗脱，每一梯度洗脱1～7个柱体积，分别收集每个柱体积的洗脱液，浓缩至干，进行TLC分离；所述TLC分离条件为：硅胶G254薄层板，体积比8～12:1的二氯甲烷-甲醇混合液作为展开剂；2)取步骤1)TLC中Rf值为0.45～0.55的组分，合并后进行反相固相萃取分离，采用BondElutC18固相萃取柱，真空固相萃取装置，湿法上样，以甲醇-水混合液作为洗脱液，且依次按100％水→25～35％甲醇→65～75％甲醇→100％甲醇进行梯度洗脱，每一梯度洗脱1～7个柱体积，收集各梯度的洗脱液，得到100％水组分、25～35％甲醇组分、65～75％甲醇组分、100％甲醇组分；3)取步骤2)中得到的25～35％甲醇组分，浓缩至干，得到粗品；4)取步骤3)中得到的粗品，用甲醇配置成0.8～1.2mg/mL，采用HPLC进行纯化；HPLC条件为：固定相：HPLC半制备柱ODS-A，20×250mm，柱内径5μm；流动相：45～55％甲醇；流速：6～10mL/min；进样量：0.95～1.05mL；检测器：光电二极管阵列检测器SPD-M20A；检测波长：210nm和220nm；收集22～28min大峰出现时的洗脱液，浓缩，即得黑麦草内酯。2.根据权利要求1所述的一种从皱瘤海鞘中分离黑麦草内酯的方法，其特征在于：所述步骤1)中，粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:5.5～6.5；以二氯甲烷-甲醇混合液作为洗脱液，且依次按100％二氯甲烷→0.8～1.2％甲醇→9.5～10.5％甲醇→49～51％甲醇→100％甲醇进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～6个柱体积，分别收集每个柱体积的洗脱液，浓缩至干，进行TLC分离；所述TLC分离条件为中，展开剂为体积比9～11:1的二氯甲烷-甲醇混合液。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：陈永轩，罗联忠，张岗，许莉，秦飞，黄立森，陈芳芳，王贵弘，
申请(专利权)人：厦门医学高等专科学校，
类型：发明
国别省市：福建;35