磷灰石原位恢复制造技术

本发明专利技术公开了再生磷灰石表面(例如在目标分析物的纯化之后)的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】磷灰石原位恢复 相关申请的交叉参考 本申请要求于2014年6月23日提交的美国临时申请第62/015, 894号和2014年 11月19日提交的美国临时申请第62/082, 017号的优先权，两者的全部内容通过引用纳入 本文。
技术介绍
在其它磷灰石固体表面之中，将磷灰石固体支持面，包括羟基磷灰石、陶瓷磷灰 石、氟磷灰石和氟强化磷灰石（fluoride enhanced apatite)，用于各种目标分析物的纯 化。磷灰石最常用于生物分析物纯化，所述生物分析物包括蛋白质、碳水化合物、多核苷酸 和病毒颗粒。磷灰石具有作为纯化支持物的独特性质，因为其在单一支持物中提供亲和性、 阳离子和阴离子交换形式。磷灰石纯化通常可以两种方式进行：（i)流动通过纯化；和（ii) 结合和洗脱纯化。 通常，对于流动通过纯化，操作人员（a)在合适的缓冲液中平衡柱；(b)在一定条 件下向柱中加入样品，在所述条件中杂质与所述柱结合而目标分子流动通过并被收集；（c) 用清洁/剥离溶液（例如高摩尔浓度磷酸盐溶液）清洁或剥离所述柱以去除吸附的生物化 合物；以及（d)用强碱性氢氧化物溶液再生或消毒所述柱从而可以重新使用所述柱。在一 些情况下，用低摩尔浓度的清洗液替代所述强碱性氢氧化物溶液，以用于长期保存或重新 平衡。 通常，对于结合和洗脱纯化，操作人员（a)在合适的缓冲液中平衡柱；(b)在一定 条件下向所述柱中加入样品，在所述条件中目标分子与所述柱结合；（c)洗脱所述目标分 子（例如用高摩尔浓度磷酸盐溶液和/或碱性卤化物溶液）；(d)用清洁溶液（例如高摩尔 浓度磷酸盐溶液）清洁或剥离所述柱以去除吸附的生物化合物；以及（e)用强碱性氢氧化 物溶液再生或消毒所述柱从而可以重新使用所述柱。在一些情况下，用低摩尔浓度的清洗 液替代所述强碱性氢氧化物溶液，以用于长期保存或重新平衡。 这些常规的磷灰石纯化方法的缺点在于差的再现性和/或过早的磷灰石劣化。在 一些情况下，该劣化是由于在暴露于平衡、加载或色谱缓冲液的过程中磷灰石表面水合氢 离子（H30+)的累积。水合氢离子的累积可在暴露于pH等于或低于8.0的碱金属盐的过程 中发生。水合氢离子的累积也可在暴露于pH小于约6. 5的磷酸盐缓冲液的过程中发生。其 它缓冲组合物也可引起水合氢离子累积。随后，当暴露于后续缓冲液，例如洗脱缓冲液（例 如在结合和洗脱纯化过程中）或清洁/剥离缓冲液（例如流动通过纯化之后）时，这些水 合氢离子解吸。所述解吸导致树脂随时间劣化，导致树脂质量损失和/或树脂的颗粒强度 降低。
技术实现思路
本专利技术人发现，在由样品纯化目标分子的色谱过程中或之后，可通过用缓冲的钙 溶液处理磷灰石固体表面，接着用磷酸盐缓冲的溶液处理，接着用碱性氢氧化物处理而明 显减少、消除或逆转磷灰石固体表面的劣化。所述缓冲的钙溶液、磷酸盐缓冲溶液和碱性氢 氧化物可接下来应用于结合和洗脱或流动通过纯化过程。 在一个方面，本专利技术提供一种用磷灰石固体表面纯化目标分析物的方法，所述方 法包括：(a)用目标分析物接触磷灰石固体表面，从而将目标分析物与一种或多种污染物 分离；(b)收集所述目标分析物；以及（c)再生所述磷灰石固体表面，所述再生包括：（i)用 缓冲的钙溶液（包含浓度至少约为5mM的钙离子和缓冲剂）接触所述磷灰石固体表面，其 中缓冲剂浓度与钙离子浓度的比例至少为约1、1. 5或2,所述溶液的pH至少为约5、5. 1、 5. 2、5. 3、5. 4或5. 5 ; (ii)用pH至少为约6. 5的磷酸盐缓冲溶液与所述磷灰石固体表面接 触；以及（iii)用含有氢氧化物的溶液接触所述磷灰石固体表面。在一个实施方式中，所述 缓冲剂是两性离子缓冲剂。在一个实施方式中，所述缓冲剂是磷酸盐缓冲剂。 在一个实施方式中，本专利技术提供一种用磷灰石固体表面纯化目标分析物的方法， 所述方法包括：(a)用目标分析物接触磷灰石固体表面，从而从一种或多种污染物中分离 目标分析物；(b)收集所述目标分析物；以及（c)再生所述磷灰石固体表面，所述再生包括： (i)用缓冲钙溶液（包含浓度至少约为10mM的钙离子和两性离子缓冲剂）接触所述磷灰 石固体表面，其中两性离子缓冲剂浓度与钙离子浓度的比例至少为约2,所述溶液的pH至 少为约6. 5 ; (ii)用pH至少为约6. 5的磷酸盐缓冲溶液与所述磷灰石固体表面接触；以及 (iii)用含有氢氧化物的溶液接触所述磷灰石固体表面。 在一个实施方式中，本专利技术提供了一种方法，其中所述方法（a)包括将所述目标 分析物与磷灰石固体表面结合，以及（b)包括从所述磷灰石固体表面洗脱所述目标分析 物。在另一个实施方式中，所述方法（a)包括将所述磷灰石固体表面与所述目标分析物接 触，从而将所述目标分析物流动通过所述磷灰石固体表面，以及（b)包括在流动通过物中 收集所述目标分析物。 在一些情况中，所述两性离子缓冲剂是含磺酸的缓冲剂。在一些情况中，所述含磺 酸的缓冲剂是MES、PIPES、ACES、M0PS0、MOPS、BES、TES、HEPES、DIPSO、TAPS、TAPSO、P0PS0 或HEPPSO、EPPS、CAPS、CAPSO或CHES。在一些情况中，所述含磺酸的缓冲剂是MES。 在一个实施方式中，所述f丐离子至少为约lmM、2mM、3mM、4mM、5mM、10mM(例如 10.ImM、10. 2mM、10. 3mM、10. 4mM或 10. 5mM)，20mM、25mM或至少为约 50mM。在另一个实施方 式中，缓冲剂浓度（例如两性离子缓冲剂浓度）与钙离子浓度的比例至少为约2. 5、3或4。 在另一个实施方式中，所述缓冲的钙溶液包含氯化钙或硝酸钙。在另一个实施方式中，所述 磷酸盐缓冲溶液包含含有约〇. 1M或0. 2M至10M磷酸盐，或0. 1M或0. 2M至0. 5M磷酸盐， pH为约6. 5-8的溶液，。在一些情况中，所述磷酸盐缓冲溶液包含400mM磷酸盐，pH为7. 0。 在一个实施方式中，所述氢氧化物包括碱性氢氧化物。在一些情况中，所述碱性氢 氧化物包括氢氧化钠或氢氧化钾。在一个实施方式中，所述再生逆转或消除了在蛋白质纯 化或柱清洁步骤中发生的所述柱的降解。在另一个实施方式中，所述再生将磷灰石固体表 面的强度增加了至少约1 %、5%、10%、15%、20%或更多。 在一个实施方式中，所述再生在洗脱吸附的生物化合物的磷酸盐清洁/剥离步骤 之前进行或替代上述步骤进行。在一些情况中，所述再生步骤在洗脱目标分析物之后进行。 在一个实施方式中，所述（ii)将所述磷灰石固体表面与含有磷酸盐，pH至少为约 6. 5的溶液接触的步骤还包括：将所述磷灰石固体表面与含有磷酸盐浓度为10mM或低于约 10mM，pH至少为约6. 5或7的溶液接触；随后将所述磷灰石固体表面与含有磷酸盐浓度至 少为约100mM、200mM、400mM或500mM，pH至少为约6. 5或7的溶液接触。 在一个实施方式中，所述再生包括（i)、清洗、（ii)和（iii)。【附图说明】 图1 :显示了进行实施例7,表X的磷灰石纯化表征的结果。 图2 :显示了所示原位再生溶液的应用之后，进行实施例7,表X的纯化表征的结 果。 图3 :本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用磷灰石固体表面纯化目标分析物的方法，所述方法包括：(a)将所述磷灰石固体表面与所述目标分析物接触，从而将所述目标分析物从一种或多种污染物中分离；(b)收集所述目标分析物；以及(c)再生所述磷灰石固体表面，所述再生包括：(i)将所述磷灰石固体表面与包含浓度至少为约5mM的钙离子以及两性离子缓冲剂的缓冲的钙溶液接触，所述两性离子缓冲剂浓度与所述钙离子浓度的比例至少为约2，所述缓冲的钙溶液的pH至少为约5；(ii)将所述磷灰石固体表面与pH至少为约6.5的磷酸盐缓冲的溶液接触；以及(iii)将所述磷灰石固体表面与含有氢氧化物的溶液接触。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·卡明斯，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US