一种高危型人乳头瘤病毒检测及分型方法技术

本发明专利技术涉及一种高危型人乳头瘤病毒检测及分型方法。本发明专利技术揭示了对于14种HPV高危型病毒具有特异性检测功能的探针，并基于核酸杂交化学发光免疫技术，开发了可实现对高危型人乳头瘤病毒(HPV)DNA进行检测和分型的技术。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学领域，更具体地，本专利技术涉及一种基于核酸杂交化学发光免 疫技术的HPVDNA分型检测技术及应用。
技术介绍
人乳头瘤病毒（Humanpapillomaviruses,简称HPV)是一种属于乳多空病毒科 的乳头瘤空泡病毒A属的二十面体DNA病毒。HPV的基因组是包含约8000个碱基对的双 链环状DNA，全部的开放阅读框（ORFs)均有一条DNA链编码。HPV根据基因组核酸序列的 同源性小于90%被分为不同的型别，在同一型内病毒基因组核酸序列差异在2-10%被视 为不同的亚型，而在同一亚型内，病毒基因组核酸序列差异小于2%，则称为该亚型的变异 株。到目前为止，研究人员发现有近百种HPV型别。不同的型别引起不同的临床表现，根据 侵犯的组织部位不同可分为：皮肤型和黏膜型。皮肤型包括与寻常巧、扁平巧、妬巧等相关 的册￥1、2、3、4、7、10、12、15等，也包括与巧状表皮发育不良有关的册￥5、8、14、17、20、36、 38等；黏膜型包括与生殖器、肛Π、口咽部、食道黏膜等感染相关的HPV6、11、13、32、34、40、 42、43、44、53、54等，也包括与子宫颈癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌等相关的册￥16、18、30、 31、33、35、39 等（JensonABetal. 1984,Humanpapillomavirus.In:BelsheRB,editor. Tex忧ookofHumanVirology.Littleton,MA:PSG-W;ri曲t;p951-68)。根据HPV对人肿瘤 的发生危害性，HPV可分为"高危型"和"低危型"HPV。低危型HPV,比如HPV6,11,42,53等 与生殖器、肛Π、口咽部、食道黏膜等感染相关，高危型HPV是引起宫颈癌等的主要原因。 德国著名医学科学家HaraldzurHausen早在上世纪70年代研究发现高危型HPV 感染是宫颈癌的成因（zurHausen吐 1977,Humanpapillomavirusesandtheirpossible roleinsquamouscellcarcinomas.Curr.Top.Microbiol.Immunol.，78:1-30)，他通过石升 究证实了两者间的直接关联性，并因此荣获2008年度诺贝尔生理学和医学奖。据中国医学 科学院肿瘤医院肿瘤研究所我国著名肿瘤流行病专家乔友林教授及其科研团队对中国的 肿瘤流行病调查研究发现，中国宫颈疾病（>CIN2)与HPV感染的相关性达96-100%(Jing Lietal. 2013,EpidemiologicalFeaturesofHumanPapillomavirus(HPV)Infection amongWomenLivinginMainlandChina.AsianPacJCancerPrev,14巧）：4015-4023)。 自1995年国际癌症协会（lARC)专题讨论会认为HPV感染是宫颈癌的主要病因，HPV的持 续感染已被认为是宫颈癌发病的必要因素和最主要病因。大量研究表明，多数宫颈上皮 内瘤变（cervicalintraepithelialneoplasia,CIN)和几乎所有的宫颈癌病变中都存 在高危型HPV感染巧emminkAJetal. 1995，Thepresenceofpersistenthi曲-risk HPVgenotypesindysplasticcervicallesionsisassociatedwithprogressive disease:naturalhistoryupto36months.IntJCancer,61 (3) :306-11)。值得注意的 是，宫颈癌的发病一般需要经历从HPV持续感染到不同程度的CIN(CIN1-CIN3)，最后发展 成为宫颈癌化oschFXet曰1.2002，Thecausalrel曰tionbetweenhumanpapillomavirus andcervicalcancer.JClinPathol, 55 (4) :244-65)。送个过程一般比较漫长，平均需要 10-15年时间，送为宫颈癌及其癌前病变的早期发现和阻断提供了足够的时间。 目前，世界卫生组织（WHO)和国际癌症研究机构（IARC)将14种HPV亚型（HPV16、 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)确定为高危型HPV型别，并且大量研究发现， 70%宫颈癌是由HPV16,18 引起的（KhanMJetal.2005，Theelevated10-yearriskof cervicalprecancerandcancerinwomenwithhumanpapillomavirus(HPV)type16or 18andthepossibleutilityoftype-speci円cHPVtestinginclinicalpractice.J 化tlCancerInst, 97 (14) : 1072-9)。因而，检测高危型HPV16和18感染对预防宫颈癌具 有十分重要的意义。 迄今为止，HPV不能在体外进行培养，随着高危型HPV与子宫颈癌的病因学关系广 泛受到重视，高危型HPV检测已经用于评估发生子宫颈癌的风险，为了能早期诊断并及时 处理，起到预防宫颈疾病（包括子宫颈癌）的发生，有必要进行HPV检测的研究。 HPV抗原的检测；HPV感染人体表皮后，在细胞内增殖合成衣壳蛋白而成为HPV抗 原成分。免疫酶染色可检测感染组织细胞内的HPV抗原蛋白L1，W了解有无HPV感染。但 由于HPV抗原免疫组化方法只能确认细胞核的衣壳蛋白，而此衣壳蛋白仅出现在HPV生 活周期中的一个阶段（在后期病毒颗粒中产生），病变程度不同抗原表达量也不同，同时， 送种方法需要大量的病毒颗粒才出现阳性反应，故此法检出率较低值illnerJ. 1999,The serologicalresponsetopapillomaviruses.SeminCancerBiol,9:423-30)。 HPV抗体的检测；HPV感染人体后，机体诱导产生抗HPV抗体，故可检测血清中抗 HPV抗体。检测抗体主要检测针对HPV16E6和E7抗体，由于其检测灵敏度不高，而且抗体 出现在疾病的晚期，不适合对疾病进行早期诊断。而且人感染HPV后，机体产生的抗体可长 期存在，血清学方法检测HPV抗体不能确定是近期感染还是既往感染。同时由于HPV型别 很多，且免疫反应不一致，所WHPV抗体检测很少使用（化azerIH. 2010，Measu;ringserum antibodytohumanpapillomavirusfollowinginfectionorvaccination.Gynecol Oncol,118(1Suppl):S8-11)。 传统的形态学方法和免疫学方法不能充分证明是否存在HPV感染，且临床灵敏 度和特异度均不够理想，会引起较高的假阳性率和假阴性率。新发展的检测方法主要用 分子生物学方法对HPV进行检测，包括基于信号扩增方法和基于模板扩增方法。基于 模板扩增方法WPCR为基础结合不同的检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于高危型HPV病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：针对HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型病毒特异性的RNA探针。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：华绍炳，胡杰锋，竺旭峰，寿莹佳，李德强，魏栓林，韩斌，
申请(专利权)人：杭州德同生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33