β-胡萝卜素高产菌种及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，该菌种的保藏号为CGMCC No.8940。所述解脂耶氏酵母CGMCC No.8940能够利用普通碳源和氮源，经发酵培养后，β-胡萝卜素产量可达到4.5g/L，是高产β-胡萝卜素的优良菌株，具有广泛的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种β -胡萝卜素高产菌种及其应用。
技术介绍
迄今为止，已报道了 600多种类胡萝卜素，来源细菌、藻类、酵母和植物兼有， β_胡萝卜素是其中之一。β_胡萝卜素作为维生素 Α的前体之一，是联合国粮农组织和 世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会认定的A类全营养食品强化剂，同时已被世界上 52个国家和地区批准使用，并被美国食品化学品添加剂典范（FCC)收载。此外，作为药物， β -胡萝卜素已被美国药典（USP) 1990版、1995版，欧洲药典1997版，英国药典（BP) 1998 版正式收载，中国卫生部颁布标准也已收载本品，中国国家药品监督管理局公布的第一 批非处方药目录亦收载本品（S.J.Chem. β-胡萝卜素国内市场分析，精细与专用化学 品，2003, 8:8-9) 〇目前，全世界β_胡萝卜素的需求量每年以7%~9%的速度增长，美国的需求量 近年以10%~15%的速度增长，全世界的β-胡萝卜素的年需求量1000t左右。2000年我 国β_胡萝卜素产量中40%用于出口，国内消费60%，其中70%用于食品工业，20%用于保 健品，10%用于药品生产，其中约75%是利用发酵法生产（S.J.Chem. β-胡萝卜素国内市 场分析，精细与专用化学品，2003, 8:8-9)。 β -胡萝卜素的分子式为C4QH56，分子量为536. 88,其有全反式、9-顺式和15-顺 式3种结构。目前生产β -胡萝卜素的方法主要有天然物提取法、化学合成法和微生物发 酵法。罗氏公司1954年最先使用化学合成法生产β-胡萝卜素，1972年BASF公司也开始 使用化学合成法生产，天然β_胡萝卜素是反式和顺式的混合构型，而化学合成的则为全 反式构型，并且随着时间的推移和研究深入，人们发现采用化学法合成的β_胡萝卜素由 于不能完全被人体吸收，并对人体产生一定程度的毒副作用，长期服用还会对人体产生不 可逆转的病变，因此化学合成的β_胡萝卜素在西方国家已被禁止用作食品添加剂。此外， β-胡萝卜素可以从胡萝卜、沙棘、番茄、马铃薯、枸杞和玉米等天然植物中提取，但是天然 物中β-胡萝卜素含量很低，提取工艺复杂，成本高，产品纯度低，而且大量种植需要耗费 很多的土地资源，种植周期较长。相对来讲，生物发酵法生产β-胡萝卜素则克服了以上两 种方法的缺点，具有生产工艺简单、周期短、成本低、产品质量好等优点。 研究发现，细菌中如光合细菌（Rhodobacter sphaeroides)等，酵母如红发夫 酉孝母（Xanthophyllomyces dendrorhous),胶红酉孝母（Rhodotorula mucilaginosa)、红 酵母（Rhodotorula glutinis)、深红酵母（Rhodotorula rubra)等，霉菌如三抱布拉氏 霉（Blakeslea trispro)，布拉克须霉（Phycomyces blakesleeanus)和卷枝毛霉（Mucor circinelloides)等和藻类如杜氏藻（Dunaliella)等都可以合成并在胞内积累类胡萝卜 素（张闯等.不同微生物生产类胡萝卜素的研究现状，2011，32(2):179-183)，总类胡萝卜 素中均含有不同比例的β-胡萝卜素。 杜氏藻（Dunaliella)和三孢布拉氏霉（Blakeslea trispro)的发酵生产技术比 较成熟，均已经进入工业化生产，其中三孢布拉氏霉（Blakeslea trispro)培养5天β-胡 萝卜素产量可高达800~900mg/L，杜氏藻（Dunaliella)发酵β-胡萝卜素在干菌体中的 含量可高达10%。但是三孢布拉氏霉由于霉菌的生殖方式等原因，其性状易发生衰退，藻类 养殖条件要求苛刻，这些不足限制了其发展，所以寻求优良菌株变得尤为重要。
技术实现思路
为了克服现有技术中的不足，本专利技术旨在提供一种β-胡萝卜素的高产菌种。首 先，借助基因组装技术，将来自于Mucor circinelloides ATCC90680的β-胡萝卜素合 成途径的2个基因 carB、carRP，及来自于解脂耶氏酵母NRRL Υ-1095的两个基因 GGS1 和tHmgl引入解脂耶氏酵母ATCC MYA2613,构建成为产β-胡萝卜素的工程菌。然后对 构建完成的工程菌解脂耶氏酵母CIBTS-1177菌株进行进一步的诱变选育，最终获得了 高产且产量稳定的β_胡萝卜素产生菌解脂耶氏酵母（异名：解脂亚罗酵母）（Yarrowia lipolytica)HCCB08563,于2014年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心（CGMCC)，菌种保藏号为CGMCC No. 8940。 因此，本专利技术的第一个目的在于提供一种解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica), 该菌种的保藏号为CGMCC No. 8940。 本专利技术的第二个目的在于提供所述的解脂耶氏酵母CGMCC No. 8940用于生产 β_胡萝卜素的应用。 本专利技术的第三个目的在于提供一种β -胡萝卜素的生产方法，通过发酵所述的解 脂耶氏酵母CGMCC No. 8940获得β -胡萝卜素，所述发酵的培养条件如下： 斜面培养基为：葡萄糖1.5~4%，蛋白胨0. 5~3%，酵母浸出粉0. 5~2%，琼 脂2% ; 种子培养基为：葡萄糖0.5~4%，蛋白胨0.2~3%，酵母浸出粉0.5~3.5% ; 发酵培养基为：葡萄糖1~7%，蛋白胨0. 5~3%，酵母浸出粉1~3. 5%，磷酸 二氢钾(λ 01~(λ 5%，磷酸氢二钾(λ 01~(λ 5%。 根据本专利技术的优选实施例，所述发酵的培养条件如下： 斜面培养基：葡萄糖2% ;胰蛋白胨2% ;酵母浸出粉1% ;琼脂2% ; 种子培养基：葡萄糖2% ;蛋白胨2% ;酵母浸出粉1% ; 发酵培养基：葡萄糖3% ;蛋白胨2% ;酵母浸出粉1% ;磷酸二氢钾0.08% ;磷酸 氢二钾 0. 08%。 本专利技术的有益效果：本专利技术以解脂耶氏酵母ATCC ΜΥΑ2613为出发菌株，经基因工 程构建和诱变筛选，获得一株解脂耶氏酵母CGMCC No. 8940,其能够利用普通碳源和氮源， 经发酵培养后，β -胡萝卜素产量可达到4. 5g/L，是高产β -胡萝卜素的优良菌株。 本专利技术提供了一种新的解脂耶氏酵母，可用于高产β_胡萝卜素，具有广泛的工 业应用前景。【附图说明】 图1为各基因模块在染色体上的整合组装顺序示意图。 图2为β-胡萝卜素生产菌的PCR鉴定结果。【具体实施方式】 以下结合具体实施例，对本专利技术做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 专利技术而非用于限制本专利技术的范围。 本专利技术的解脂耶氏酵母（异名：解脂亚罗酵母）（Yarrowia lipolytica) HCCB08563已于2014年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心（CGMCC)，保藏地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号 CGMCC No. 8940。 实施例1、工稈菌的构律 1. 1、实验方案及引物设计 在解脂耶氏酵母 ATCC MYA2613 (购自 ATCC，USA，菌株信息：M本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，其特征在于，该菌种的保藏号为CGMCC No.8940。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高书良，蒋宇，朱丽，杨晟，戈梅，罗敏玉，蒋美珍，
申请(专利权)人：上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司，上海工业生物技术研发中心，
类型：发明
国别省市：上海;31