一种甘薯病毒苗的茎尖脱毒方法技术

本发明专利技术涉及了一种甘薯病毒苗茎尖脱毒及培养方法，所述方法包括以下步骤：(1)取已感染薯羽状斑驳病毒和/或甘薯G病毒的薯块，室内培养至萌芽；(2)剪取生长至1.5～2.0cm长的顶芽进行消毒；(3)从步骤(2)所得顶芽中无菌剥离带2个叶原基的茎尖作为外植体进行接种培养，获得再生植株；(4)对步骤(3)所得再生植株经2～3次继代培养建立株系，依次采用指示植物法和硝酸纤维素膜酶联免疫吸附法进行检测，获得脱毒株系；(5)对脱毒株系进行快速繁殖，即得脱毒苗。本发明专利技术提供的方法能快速建立其适用于大多数甘薯品种/品系的茎尖培养和脱毒苗快繁的培养体系。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，特别涉及甘薯茎尖分生组织的形态学结构和组织培养技术，即是涉及一种一种甘薯病毒苗的茎尖脱毒方法。
技术介绍
甘薯(Ipomoea batatas L.)是一种重要的粮食、饲料和工业原料作物，具有产量高、营养丰富、适应性强、稳定性好等优点。当前推广的甘薯品种，一般是有性杂交一代的无性系，在遗传上是高度杂合的，因此生产上利用薯块进行无性繁殖来保持优良种性的要求。甘薯生产中是以薯块留种并年年进行无性繁殖，种薯一旦受到病毒病的浸染，便造成病毒病的积累而蔓延，从而造成甘薯总产量降低、品质下降，甚至种性退化等严重问题，显然病毒病给甘薯生产带来巨大威胁，是当今现代农业高能源型甘薯产业化发展中必须高度重视的高危病毒病问题。Morel和Martin早在1952年就利用分生组织培养获得大丽花和马铃薯脱毒苗，同时建立了茎尖脱毒的组织培养技术体系。然而直至目前，对病毒在植物体内分布不均一性的机理还不十分清楚，通过大量的研究认为，基本已经证实了茎尖分生组织并不是完全没有病毒，只是不带或很少带有病毒，在实际应用中依然是以几种假说作为理论依据。但就脱毒而言，茎尖仍然是植物脱毒培养并得以保持物种种性更为理想的外植体，在甘薯组织培养研究中也是首选外植体。为此，利用茎尖脱毒仍然是甘薯生产中无性繁殖作物杂种一代无性系优势利用的主要途径。茎尖的叶原基个数直接影响到茎尖培养成苗率及其脱毒效果，不带叶原基的茎尖分生组织则成苗困难，而分离多个叶原基的茎尖分生组织又会对脱毒效果产生不利影响。专利文献CN103190264A公开了一种马铃薯茎尖脱毒方法，包括以下步骤：1)将需要脱毒的原原种进行田间播种；2)植株生长期常规管理；3)在现蕾或开花期从马铃薯地里筛选健康的植株，做好标记，较其他植株提前半个月收获，每株筛选个大，薯型标准和健康的种薯单独收获和贮存；4)种薯发芽后，剪取幼芽进行病毒检测；5)将检测健康的种薯，重新催芽后剪取大芽经酒精和升汞杀菌处理后，放于常规MS固体培养基上做成茎段苗；6)将长高的茎段苗，剪取上部三分之一高度保种，剩余三分之二进行病毒检测；7)病毒检测合格后，按照常规方法进行快繁；通过本专利技术可以在相对短的周期内获得马铃薯脱毒试管苗，得到的脱毒试管苗健康，遗传基因稳定。但是该方法无法适用于大多数甘薯品种/品系的甘薯茎尖培养和脱毒苗快繁的培养体系。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适用于多种甘薯品种/品系的甘薯病毒苗茎尖脱毒及培养方法，所述甘薯病毒为薯羽状斑驳病毒和/或甘薯G病毒。为了实现上述目的，本专利技术提供的一种甘薯病毒苗茎尖脱毒及培养方法，包括以下步骤：(1)材料培养：取已感染薯羽状斑驳病毒和/或甘薯G病毒的薯块，室内培养至萌芽；(2)材料消毒：剪取生长至1.5～2.0cm长的顶芽进行消毒；(3)接种培养：从步骤(2)所得顶芽中无菌剥离带2个叶原基的茎尖作为外植体进行接种培养，获得再生植株；(4)株系建立与病毒检测：对步骤(3)所得再生植株经2～3次继代培养建立株系，依次采用指示植物法和硝酸纤维素膜酶联免疫吸附法进行检测，获得脱毒株系；(5)快速繁殖：对脱毒株系进行快速繁殖，即得脱毒苗。本专利技术所述步骤(1)具体为：选取收获已携带病毒的薯块，洗净表面后用30～35mg/kg赤霉素(GA3)浸种25～30min，用消毒湿砂覆埋于25～27℃黑暗催芽，当芽露出砂面后用38～40℃热处理7～8d。本专利技术所述步骤(2)中，所述消毒具体为：先用体积分数为75％乙醇浸泡25～30s，无菌水冲洗一遍，然后用质量分数为0.1％的HgCl2浸泡8～10min，无菌水冲洗3～5遍。本专利技术所述步骤(3)中，所述茎尖大小为0.22～0.35mm；茎尖形态为突起态、半闭合态或闭合态；其中，半闭合态和闭合态的成苗培养效果好，突起态的脱毒效果好；所述无菌剥离具体为：用镊子夹取消毒材料置于垫有湿润滤纸的无菌培养皿中，然后在双目体视镜下，一只手用一根解剖针按住茎尖的另一端，另一只手持解剖针纵向去掉包围在茎尖外层的几层幼叶，当接近茎尖生长点之下的第3～4个幼叶时，要求做到剥去一层/片幼叶的解剖针就应在酒精灯火焰上灼烧一次重新灭菌，同时并转移材料在滤纸上的位置，待无菌剥离至2个叶原基时，并再一次重新对解剖针进行灭菌，待针尖冷却后将茎尖分生组织横切下来，迅速将已经粘附到针尖上的茎尖接种到茎尖培养基上；所述接种培养的培养基由以下成分组成：基本培养基MS，0.8～1.4mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(BAP)，0.01～0.02mg/Lα-萘乙酸(NAA)；或基本培养基MS，0.2～0.8mg/L BAP，0.1～0.2mg/L3-吲哚乙酸(IAA)；所述接种培养的培养条件为：温度25～30℃，光照强度1600Lx，光照时数12～14h。本专利技术所述步骤(4)中，所述检测具体为：以试管苗株系对巴西牵牛用涂抹法和嫁接法观察病毒引起的症状，以巴西牵牛为指示植物进行检测后确认无毒的试管苗株系再用硝酸纤维素膜酶联免疫检测法(NCM-ELISA)进行检测；其中，NCM-ELISA检测程序为：样品采集→在膜上点样→加入封阻液→冲洗→添加特异病毒抗体→冲洗→加入酶标抗体→冲洗→显色→终止反应，得到无紫色反应(阴性)的脱毒株系。本专利技术所述步骤(5)中，所述快速繁殖的培养基由以下成分组成：MS基本培养基，0.1～0.2mg/L IAA，0.1～0.5mg/L GA3；所述快速繁殖的条件为：温度28～30℃，光照时数12～16h。作为优选方案，本专利技术所述方法包括以下步骤：(1)材料培养：选取已感染薯羽状斑驳病毒和/或甘薯G病毒的薯块，洗净表面后用30～35mg/kg GA3浸种25～30min，用消毒湿砂覆埋于25～27℃黑暗催芽，当芽露出砂面后用38～40℃热处理7～8d；(2)材料消毒：剪取生长旺盛的长1.5～2.0cm顶芽，在超净工作台上切去完全展开的叶片，然后消毒；消毒时将材料先用体积分数为75％乙醇浸泡25～30s，无菌水冲洗一遍，然后用质量分数为0.1％的HgCl2浸泡8～10min，无菌水冲洗3～5遍；(3)接种培养：在解剖镜下无菌剥离0.22～0.35mm大小的生长点带2个叶原基，接种在预先制备好的培养基中，培养基组成为：MS基本培养基+0.8～1.4mg/L BAP+0.01～0.02mg/LNAA+0.1～0.2mg/L GA3；或MS基本培养基+0.2～0.8mg/L BAP+0.1～0.2mg/L IAA+0.1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘薯病毒苗茎尖脱毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)材料培养：取已感染薯羽状斑驳病毒和/或甘薯G病毒的薯块，室内培养至萌芽；(2)材料消毒：剪取生长至1.5～2.0cm长的顶芽进行消毒；(3)接种培养：从步骤(2)所得顶芽中无菌剥离带2个叶原基的茎尖作为外植体进行接种培养，获得再生植株；(4)株系建立与病毒检测：对步骤(3)所得再生植株经2～3次继代培养建立株系，依次采用指示植物法和硝酸纤维素膜酶联免疫吸附法进行检测，获得脱毒株系；(5)快速繁殖：对脱毒株系进行快速繁殖，即得脱毒苗。

【技术特征摘要】
1.一种甘薯病毒苗茎尖脱毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)材料培养：取已感染薯羽状斑驳病毒和/或甘薯G病毒的薯块，室内培养至萌芽；
(2)材料消毒：剪取生长至1.5～2.0cm长的顶芽进行消毒；
(3)接种培养：从步骤(2)所得顶芽中无菌剥离带2个叶原基的茎尖作为外植体进行接
种培养，获得再生植株；
(4)株系建立与病毒检测：对步骤(3)所得再生植株经2～3次继代培养建立株系，依次
采用指示植物法和硝酸纤维素膜酶联免疫吸附法进行检测，获得脱毒株系；
(5)快速繁殖：对脱毒株系进行快速繁殖，即得脱毒苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述消毒具体为：先用体积分
数为75％的乙醇浸泡25～30s，无菌水冲洗一遍，然后用质量分数0.1％的HgCl2浸泡8～10min，
无菌水冲洗3～5遍。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述茎尖大小为0.22～0.35mm。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述茎尖形态为突起态、
半闭合态或闭合态。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述接种培养的培养基由以下
成分组成：基本培养基MS，0.8～1.4mg/L BAP，0.01～0.02mg/L NAA；或基本培养基MS，
0.2～0.8mg/L BAP，0.1～0.2mg/L IAA。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述接种培养的培养条件为：
温度25～30℃，光照强度1600Lx，光照时数12～14h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述检测具体为：以试管苗株
系对巴西牵牛用涂抹法和嫁接法观察病毒引起的症状，以巴西牵牛为指示植物进行检测后确
认无毒的试管苗株系再用NCM-ELISA法进行检测。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述快速繁殖的培养基由以下
成分组成：MS基本培养基，0.1～0.2mg/L IAA，0.1～0.5mg/L GA3。
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄远新，王季春，张凯，唐道彬，何凤发，吕长文，赵勇，刘勋，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85