本发明专利技术公开了一种可利用峨眉金线莲种子快速繁育种苗的方法，全过程不使用激素，以分布于四川峨眉山地区的野生或人工种植开花后受粉5个月成熟未开裂金线莲果实为材料，通过种子→原球茎→完整植株→炼苗移栽的途径高效快速地繁育种苗。整个过程使用无激素的培养基，一颗成熟果实通过10-12个月左右的组织培养，可快繁培育出5000株以上的优质种苗，经炼苗移栽温室大棚培养成活率可达95%以上。本发明专利技术方法可以保持峨眉金线莲的优良性状，保持其优良的药性，且方法简单、成本低，可以实现工厂化育苗，而且不使用激素，保证了种苗的安全性，对极度濒危的珍稀药用植物资源的再生和可持续利用及种质资源的保护都具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物组织培养
，具体涉及一种利用峨眉金线莲成熟蒴果无激素快速繁育有机种苗的方法。
技术介绍
峨眉金线莲(Anoectochilus emeiensis K. Y. Lang.)是兰科(Orchidaceae)、开唇兰属(Anoectochilus)多年生草本植物，同花叶开唇兰、台湾、福建、广东、广西金线莲等统称为金线莲。在民间常作药用，其氨基酸组成、成分、含量及维生素、多糖等含量均高于西洋参和野山参。其性平味甘，具有清热、凉血、祛风利湿、强心利尿、固肾平肝以及降血压等功效，在治疗肝病、高血压、糖尿病及肿瘤等方面有良好的效果。另外，金线莲也是观赏价值极高的观赏植物。但是，由于金线莲属植物的种子微小，不具胚乳，无发芽能力，只有与真菌共生的情况下才能萌发，因此，发芽率低，野外生长条件苛刻，自然繁殖和生长缓慢。另外由于峨眉金线莲的生境地破坏严重，野生峨眉金线莲资源非常稀少，现已濒临灭绝。目前已有的研究主要集中在台湾、福建、广东及广西金线莲中，多以茎段为外植体材料进行繁殖，未见有利用峨眉金线莲蒴果快繁育苗的报道。而且所用培养基多含激素，会造成激素富集到金线莲种苗中，产品质量达不到有机产品的标准，为此开展峨眉金线莲种子无激素人工快速培养的研究，建立一套种苗的组织培养快繁体系，对合理保护开发峨眉金线莲种质资源并产业化、规模化生产有机种苗有着十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用峨眉金线莲成熟未开裂果实及无激素培养基快速繁育种苗的方法，本方法不仅可以进行规模化生产有机种苗，而且也能有效保护野生资源。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种峨眉金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法，所述方法包括如下步骤： a、选取开花后受粉成熟但未开裂的金线莲蒴果作为外植体材料，选择内部种胚颜色已由白色转变为金黄色丝状的果实进行消毒处理；b、种胚萌发及原球茎分化：将消毒后的蒴果剖开，取出内部种子，均匀撒播到种胚萌发及原球茎分化培养基上，暗培养10~20天，而后按照光照8h/d→10h/d→12h/d→14h/d梯度增加光照时间培养，各级培养25~30天，种子萌发形成原球茎并分化形成带2片叶长2-3cm的完整芽苗植株；c、壮苗及生根培养；将已分化为完整芽苗的植株转接到壮苗及生根培养基上，在温度22-25℃，光照强度2000lux，光照时间14-16h/d的条件下培养4-6月，培养出6-7cm根系发达的完整大苗；d、炼苗及移栽温室大棚培养：经生根培养的完整大苗经逐步炼苗后从瓶中取出，小心清洗净根部培养基，待植株表面水分稍干后移栽温室大棚培养，移栽后保持温室大棚温度22-32℃，湿度65～75%，成活率可达95%以上。进一步的，所述步骤b中种胚萌发及原球茎分化培养基为：MS培养基＋香蕉汁100g/L＋蔗糖25～35g/L＋琼脂6～8g/L＋活性炭1.5～2.5g/L，pH值为5.8～6.2。进一步的，所述步骤c中壮苗及生根培养基为：改良MS培养基＋马铃薯汁200g/L＋蔗糖25～35g/L＋琼脂6～8g/L＋活性炭1.5～2.5g/L，pH值为5.8～6.2。所述改良MS培养基是在MS培养基基础上，大量元素减半，微量元素及有机母液等不变。进一步的，所述步骤a所述消毒处理是指将外植体材料用自来水冲洗2～3小时，然后用软毛刷清洗，用蒸馏水冲洗后置超净工作台内，75%酒精浸泡45s-60s，无菌水清洗干净，再用0.1%的升汞溶液进行表面消毒15min，无菌水清洗4-5次，每次2分钟，最后用无菌滤纸吸干材料表面水分。进一步的，所述步骤d移栽温室大棚培养是指生根壮苗培养后，炼苗2-3周左右，组培苗长至6～7cm高时移栽至温室大棚，移栽用介质为腐殖土加少量珍珠岩的混合物，移栽前用800-1000倍多菌灵或百菌清加生根粉50mg/kg浸根15-20min。所述炼苗是将组培瓶置于温室大棚1-2周，然后松盖2-3天，部分开盖2-3天，完全去盖。所述腐殖土与珍珠岩的重量份数比为3~4:1。进一步的，所述步骤d所述温室大棚采用双层遮荫网遮光，外层是一层固定的50%遮荫网，内层为可活动的遮荫网，便于调节光照强度，移栽2周内需遮光80-90%，之后需遮光60%，温室大棚中温度控制在20～26℃，相对湿度控制在65～75%。进一步的，所述步骤a中所述金线莲是指生长在峨眉山地区的野生或人工种植开花后受粉5个月成熟峨眉金线莲未开裂蒴果。本专利技术相比现有技术的有益效果是：本专利技术是以峨眉金线莲成熟未开裂果实为外植体，通过种子→原球茎→完整植株→炼苗移栽的途径高效快速地繁育种苗。整个过程使用无激素的培养基，一颗成熟果实通过10-12个月左右的组织培养，仅通过原球茎转接一次无需再次继代培养直接分化成完整的植株，可快繁培育出5000株以上的优质种苗，经炼苗移栽温室大棚培养成活率可达95%以上。本专利技术方法可以保持峨眉金线莲的优良性状，保持其优良的药性，且方法简单、成本低，可以实现工厂化育苗，而且不使用激素，保证生产出的种苗不会残留超标，能为生产金线莲有机产品提供优质种苗，另外对极度濒危的珍稀药用植物资源的再生和可持续利用及种质资源的保护都具有重要的意义。具体实施方式实施例一本专利技术具体可以按照以下方式实施，峨眉金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法，包括如下步骤： a、选取9～10月份野生或人工种植开花后受粉5个月成熟未开裂金线莲蒴果作为外植体材料，选择内部种胚颜色已由白色转变为金黄色丝状的果实进行消毒处理：用自来水冲洗2～3小时，然后用软毛刷清洗，用蒸馏水冲洗后置超净工作台内，75%酒精浸泡45s-60s，无菌水清洗干净，再用0.1%的升汞溶液中表面消毒15min，无菌水清洗4-5次，每次2分钟最后用无菌滤纸吸干材料表面水分。b、种胚萌发及原球茎分化：将消毒后的蒴果剖开，取出内部种子，均匀撒播到萌发及分化培养基上，先暗培养15天，光照8h/d→10h/d→12h/d→14h/d梯度增加光照时间培养，光照强度为2000lux，培养温度为22～25℃，各级培养30天，种子萌发形成原球茎并分化形成带2片叶长2-3cm的完整芽苗植株；所述萌发及分化培养基为：MS培养基＋香蕉汁100g/L＋蔗糖25～35g/L＋琼脂6～8g/L＋活性炭1.5～2.5g/L，pH值为5.8～6.2；c、壮苗及生根培养；将已分化为完整芽苗的植株转接到壮苗及生根培养基上，在温度22-25℃，光照强度2000lux，光照时间14-16h/d的条件下培养4-6月，培养出6-7cm根系发达的完整大苗；所述壮苗及生根培养基为：改良MS培养基(大量元素减半，微量元素及有机母液等不变)＋马铃薯汁200g/L＋蔗糖25～35g/L＋琼脂6～8g/L＋活性炭1.5～2.5g/L，pH值为5.8～6.2； d、炼苗及移栽温室大棚培养：经生根培养的健壮大苗经逐步炼苗(将组培瓶置于温室大棚1-2周，然后松盖2-3本文档来自技高网...
【技术保护点】
峨眉金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：a、选取开花后受粉成熟但未开裂的金线莲蒴果作为外植体材料，选择内部种胚颜色已由白色转变为金黄色丝状的果实进行消毒处理；b、种胚萌发及原球茎分化：将消毒后的蒴果剖开，取出内部种子，均匀撒播到种胚萌发及原球茎分化培养基上，暗培养10~20天，而后按照光照8h/d→10h/d→12h/d→14h/d梯度增加光照时间培养，各级培养25~30天，种子萌发形成原球茎并分化形成带2片叶长2‑3cm的完整芽苗植株；c、壮苗及生根培养；将已分化为完整芽苗的植株转接到壮苗及生根培养基上，在温度22‑25℃，光照强度2000lux，光照时间14‑16h/d的条件下培养4‑6月，培养出6‑7cm根系发达的完整大苗；d、炼苗及移栽温室大棚培养：经生根培养的完整大苗经逐步炼苗后从瓶中取出，小心清洗净根部培养基，待植株表面水分稍干后移栽温室大棚培养，移栽后保持温室大棚温度22‑32℃，湿度65～75%，成活率可达95%以上。
【技术特征摘要】
1.峨眉金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a、选取开花后受粉成熟但未开裂的金线莲蒴果作为外植体材料，选择内部种胚颜色已由白色转变为金黄色丝状的果实进行消毒处理；
b、种胚萌发及原球茎分化：将消毒后的蒴果剖开，取出内部种子，均匀撒播到种胚萌发及原球茎分化培养基上，暗培养10~20天，而后按照光照8h/d→10h/d→12h/d→14h/d梯度增加光照时间培养，各级培养25~30天，种子萌发形成原球茎并分化形成带2片叶长2-3cm的完整芽苗植株；
c、壮苗及生根培养；将已分化为完整芽苗的植株转接到壮苗及生根培养基上，在温度22-25℃，光照强度2000lux，光照时间14-16h/d的条件下培养4-6月，培养出6-7cm根系发达的完整大苗；
d、炼苗及移栽温室大棚培养：经生根培养的完整大苗经逐步炼苗后从瓶中取出，小心清洗净根部培养基，待植株表面水分稍干后移栽温室大棚培养，移栽后保持温室大棚温度22-32℃，湿度65～75%，成活率可达95%以上。
2.根据权利要求1所述的金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法，其特征在于：所述步骤b中种胚萌发及原球茎分化培养基为：MS培养基＋香蕉汁100g/L＋蔗糖25～35g/L＋琼脂6～8g/L＋活性炭1.5～2.5g/L，pH值为5.8～6.2。
3.根据权利要求1所述的金线莲种子无激素快速组培繁殖的方法，其特征在于：所述步骤c中壮苗及生根培养基为：改良MS培养基＋马铃薯汁200g/L＋蔗糖25～35g/L＋琼脂6～8g/L...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲁松，熊铁一，
申请(专利权)人：四川省自然资源科学研究院，峨眉山生物资源实验站，
类型：发明
国别省市：四川;51
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