本发明专利技术描述了一种用于样品的显微镜成像的方法，其中设置有样品井，该样品井填充有液体并且包括具有底部的井结构，并且其中所述样品粘附于所述样品井的所述底部，其中：(a)使用照明辐射照亮所述样品井，并且(b)捕获所述样品井的所述底部的至少一个样品图像，其中通过如下步骤校正由所述井导致的所述底部的照明的任何不均匀性：(c)设置测试井，(d)通过使用所述照明辐射照亮所述测试井，捕获覆盖所述测试井的整个底部的参考图像，(e)分析所述参考图像，以确定亮度校正规范，(f)所述亮度校正规范被用来校正所述样品图像。本发明专利技术使得所述底部的照明被改进以用于成像。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于样品的显微镜成像的方法，其中提供有填充有液体并且具有井结构的样品井，所述井结构包括底部，并且其中所述样品粘附于所述样品井的底部，其中:(a)样品井被照明辐射照亮，并且(b)被照亮的样品井的底部从样品井的下侧被放大地成像，并且样品井的底部的至少一个样品图像被捕捉。
技术介绍
活细胞的显微镜检查在生物医学中扮演了重要的角色。这些细胞经常在具有井的微量滴定板中被培养。然而，还使用其它独立的井。所述细胞定位在底部上并且被培养基包围。它们通常使用倒置显微镜经历显微镜检查；在该显微镜中，物镜位于井的底部下方。样品可以通过入射光或透射光被照亮。对于透射光成像，光源设置在井的上方。然而，由于生物细胞仅包含很少的吸收成分，所以明视野的透射光图像通常具有较低的对比度。在诸如相位对比、尤其是DIC的各种透射光对比法的帮助下，单个的细胞成分彼此之间的以及单个的细胞成分与周围介质之间的折射率的微小差异可以被转换为光强(intensity，强度，亮度)差，然后该光强差提供高对比度的透射光图像。特别地，本专利技术涉及粘附于微量滴定板的井的底部的样品的透射光显微镜检查。该底部被透射光照明并且被以高分辨率成像在显微镜上。这类显微镜检查与诸如DE10200541 A1中所述的整个微量滴定板的通常的成像不同，该成像惯常用在现有技术水平的其它应用中。当底部被单独地或以小组地在透射光中放大成像时，对透射光照明的质量的要求会更高。对于命名为透射光对比法的方法尤其是这样。本专利技术的领域还与所谓的荧光读取仪不同，该荧光读取仪检查液体是否或者如何强烈地在微量滴定板的井中发荧光。此处，通常地，对微量滴定板的所有井的检测也同时进行。此外，底部的照明的质量在这些应用中是不相关的。US 6074614涉及微量滴定板的这种使用并且提供盖板，该盖板具有适于微量滴定板的多个圆柱形突起，其中该圆柱形突起浸入微量滴定板的可能发荧光的液体中。目的是保证在激发和读取荧光时通过微量滴定板的井的光束路径的长度尽可能地一致。微量滴定板的井的底部的照明的问题不起任何作用。在显微镜检查中，图像质量不仅取决于所使用的成像光学，还取决于照明的质量。包括物镜、镜筒透镜、目镜或照相机的成像系统尽可能精确地对样品平面中的环境成像。这些环境受样品本身以及照明光场的影响。该光场的特性由物场(照明)中的光强分布和照明角度分布表征，即来自所述多面角度的光线到达物场的每一个单独的点(照明的数值孔径(numerical aperture，ΝΑ))。然而，该照明效果通常不是该研究的目的，而感兴趣的是样品。因此，旨在实现尽可能均匀的照明以达到使用相同角度的光谱的光线照亮物场的每一点的效果。这既适用于其中光线发出通过样品并且被位于另一侧的成像物镜收集的透射光照明，还适用于其中照明被发出通过成像物镜的入射光照明。在透射光中，通过Koehler型照明最佳地获得所述环境。然而，即使那样，照明也不会是完全均一的。使用基于肉眼的检查，这是不要紧的，因为，一方面人眼只能较差地识别光强的微小差异，并且另一方面特定地在当前的视野中总是只能看见一个图像。即使在视野的边缘处的光强看得见地稍微下降，在多数情况下这也不是问题。在使用基于照相机的图像捕获的观察中，情形就严重得多。光强的微小差异被更好地检测，并且然后被视为干扰。该效应尤其在全景/拼接图像中出现。在极端的情况下，拼接算法可能需要更多的时间进行图像配准，或者配准甚至变得不可能。为了避免这种效应，可以实施黑点校正(shading correct1n)。这例如通过捕获没有样品的参考图像来进行。该参考图像包含干扰完美的照明和成像的照明伪影。其例如为已在上面描述的不均匀的照明，还可以是可能位于个别镜头、镜子或光束路径中的其它元件上的灰尘和污物，正如光束路径的任何有缺点的调整。所有这些效应在本文中被概括在术语“黑点”之下，其在使用所述光束路径捕获的每一个图像中出现。如果已知参考图像，那么可以通过所谓的黑点校正校正样品图像。这样的方法例如在US 2010/0188497中描述过。还存在其中在没有之前的参考图像的捕获的情况下黑点可被识别出并且被去除的方法。关于这一点可以参考W0 13/094273。然而，所有这些方法仅识别和校正与光束路径有关的黑点，即与样品位置无关、但是定像于光束路径的参考系统内的黑点。样品关于一个或多个物场在一个方向上的任何移位不会改变与该光束路径有关的黑点的任何事情。因此，该参考图像不会随样品的移位而改变。在US 2003/039402中，描述了一种方法，该方法可以在扫描图像中去除划痕或其它伪影。原则上，该方法也可以转用于显微镜检查，并且该方法将可以识别和去除样品平面中的诸如微小头发的特定的伪影。然而，为了检测黑点，将需要有关伪影的类型的先验的知识，否则，图像分析不能确定图像的哪些元素可以被指定为样品以及哪些元素是黑点。在黑点的特征不在于轮廓清晰的结构，而在于具有空间延伸的亮度梯度的情况下，该方法也会失效。
技术实现思路
因此，本专利技术提供一种用于粘附于井的底部的样品的显微镜成像的方法，以使得所述底部的照明被改进以用于成像。本专利技术提供一种用于样品的显微镜成像的方法，其中设置有样品井，该样品井填充有液体并且包括具有底部的井结构，并且其中所述样品粘附于所述样品井的所述底部，其中:(a)使用照明辐射照亮所述样品井，并且(b)从所述样品井的下侧对被照亮的样品井的所述底部进行放大成像，并且捕获所述样品井的所述底部的至少一个样品图像，其中通过如下步骤校正由所述井导致的所述底部的照明的任何不均匀性:(c)设置测试井，该测试井填充有液体，并且具有与所述样品井相同的井结构，但不具有样品，(d)通过使用所述照明辐射照亮所述测试井，在所述测试井上实施参考测量，从所述测试井的下侧对被照亮的测试井的底部成像，并且捕获覆盖所述测试井的整个底部的参考图像，(e)分析所述参考图像，以确定亮度校正规范，其中所述亮度校正规范表示亮度波动，所述亮度波动是在所述测试井的所述底部上的位置的函数，(f)用所述亮度校正规范来校正所述样品图像，其中确定所述样品图像的至少一部分在所述底部上的位置，并且使用所述亮度校正规范中被分配给所述底部上的该位置的值。本专利技术基于以下认识:相对样品容器的参考系统固定的基于样品容器的黑点不会被所述的方法识别并且因此不能被校正。当样品容器本身的结构导致黑点时，会存在基于样品容器的黑点。特别地，这例如在如下文描述的小容器(微量滴定板)中发生。当样品被移动时，所述黑点也移动。因此，它总是在基于样品容器的参考系统的同一点处，但是不能被分配给基于光束路径的参考系统的任何固定位置。特别地，亮度梯度发生在微量滴定板的透射光照明中。微量滴定板是尤其被用在活细胞的观察中的样品容器。这些板配备有每隔一定间隔的例如24、96或384个规定数量的井。诸如细胞或胚的样品可以被引入这些井的每一个中。为了显微镜观察，所述井设置有例如由聚苯乙烯或玻璃制成的透明底部。所述井的光学属性具有对透射光的照明的显著的干扰效应。在下文中，将使用包括具有11mm的高度和7mm的直径的96个井的微量滴定板来说明该效应。井的上边缘截取透射光照明的光锥，从该锥上，光线可以到达井的底部的特定点并且可以在本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于样品的显微镜成像的方法，其中设置有样品井，该样品井填充有液体并且包括具有底部的井结构，并且其中所述样品粘附于所述样品井的所述底部，其中：(a)使用照明辐射照亮所述样品井，并且(b)从所述样品井的下侧对被照亮的样品井的所述底部进行放大成像，并且捕获所述样品井的所述底部的至少一个样品图像，其中通过如下步骤校正由所述井结构和/或所述液体导致的所述底部的照明的任何不均匀性：(c)设置测试井，该测试井填充有液体，并且具有与所述样品井相同的井结构，但不具有样品，(d)通过使用所述照明辐射照亮所述测试井，在所述测试井上实施参考测量，从所述测试井的下侧对被照亮的测试井的底部成像，并且捕获覆盖所述测试井的整个底部的参考图像，(e)分析所述参考图像，以确定亮度校正规范，其中所述亮度校正规范表示所述参考图像中的亮度波动，所述参考图像中的亮度波动是在所述测试井的所述底部上的位置的函数，(f)用所述亮度校正规范来校正所述样品图像，其中确定所述样品图像的至少一部分在所述底部上的位置，并且使用所述亮度校正规范中被分配给所述底部上的该位置的值。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：托尔斯滕·库斯，彼得·舒恩，
申请(专利权)人：卡尔蔡司显微镜有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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