用于分析透明或低对比度样本的自动显微镜聚焦系统和方法技术方案

一种显微镜系统和方法凭经验确定物镜的景深的边界。所述系统和方法很大程度上自动化，其中待成像的样本的操纵由处理器和相关联设备实行。经验景深的计算也同样自动化。在凭经验确定所述景深的所述边界后，所述样本(尤其当透明或半透明时)可即刻在小于所述景深的用户界定的深度处准确成像。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术大体涉及显微镜，且更特定来说涉及用于凭经验确定聚焦在透明或低对比度样本上的物镜的焦点的工作距离和深度的显微镜系统和方法。本专利技术提供可有益地聚焦在透明或低对比度样本的经界定深度上的显微镜系统和方法。
技术介绍
所有光学显微镜都需要借以提供聚焦以便清楚地使样本成像的机构。在许多情形中，系统聚焦取决于样本具有视觉上可辨识的特征。这些特征产生用于聚焦的必要对比度。在其它情形中，确定到样本的距离，且通过物镜的已知焦长设定焦点。透明样本为建立适当聚焦提出了特殊挑战，且需要仅本领域极其熟练的技术人员已知的特别的技术来改进到可能发生适当聚焦的点的对比度。显微镜传统上通过增加或减小显微镜物镜与样本之间的距离直到图像对于显微镜人员呈现为焦点对准为止来进行聚焦。显微镜的聚焦因此通常某种程度上具有主观性，且显微镜必须具有焦点调整能力以便适当视觉化样本的表面特征。更通常的做法是，提供旋钮以移动物镜或固持样本的载物台以便调整物镜与样本之间的相对距离，且显微镜人员操纵此旋钮直到他主观上相信已达到最佳聚焦为止。因此，尽管需要更加精细的准确度，但显微镜人员基本上维持借以主观上确定聚焦的主观工具。技术已通过两种基本方法将主观性排除出聚焦的确定。第一方法通过感测从样本表面反射的光(例如，近红外)来测量物镜与样本之间的距离以提供反馈来自动控制聚焦。此类型的方法由尼康(Nikon)公司(日本)描述。在另一方法中，尼康公司还描述使用经反射声音来测量距离。如Mot1nX公司(美国)例如在其FocusTrac Laser Auto FocusSystems, and Pr1r Scientif ic (美国)中描述的激光聚焦控制系统还通过测量物镜与样本之间的距离且提供反馈用于焦点调整来促进聚焦。美国专利N0.7，345，814进一步描述激光聚焦系统。在一些情况下，这些方法归因于样本反射性和透明度而在透明样本上聚焦时存在困难。这些距离测量方法通常需要添加硬件和控制软件以促进使用标准显微镜进行聚焦。美国专利N0.5，594，235使用共焦传感器来最佳测量高度或Z轴点(如其在现有技术中所提及)。预先确定给定数目的z点，且接着评估每一者的反射率。归因于不同程度的反射率，可确定表面的每一点处的高度。虽然此可视为最高点测量的工具，但其还确保聚焦准确性的特定置信度。使显微镜聚焦的第二已知方法是随着显微镜物镜与样本之间的距离增加和减小而比较图像的对比度。这基本上是显微镜人员用于视觉上确定样本处于焦点对准(如上所述)的方法。所述方法容易通过使用例如(但不限于)C⑶或CMOS传感器等传感器以电子方式俘获样本图像而自动化。此方法由Groen和Young等人在“A Comparison of DifferentFocus Funct1ns for Use in Autofocus Algorithms，，Cytometry 6:81-91 (1985)中详细描述。然而，此对比度比较方法不能在完全透明或在图像内不具有对比度的样本上使用。采用使用显微镜的景孔径(F制光圈，F-Stop)的方法在样本上聚焦。此方法由Chow和Liu描述，尼康光学显微镜，基本操作程序，http://nanomech.me.Washington,edu/pdfs/nikon.pdf，2009 年 I 月，且进一步在耐诺(Nanometrics)公司的 NanoSpec?3000实验室指南，NanoSpec Film Thickness Measurement System，第 8.33 章中描述。在此方法中，F制光圈关闭以便将F制光圈投影在样本上，且调整焦点(即，相对移动样本和物镜)使得对比度增加和/或减小。在最大对比度点处，样本视为处于焦点对准且F制光圈打开以允许样本的成像。在显微镜成像过程中，样本主要经由物镜放大。每一物镜具有相关联景深，有时也称为焦深。尼康公司将景深界定为从处于焦点对准的最近物平面到也同时处于焦点对准的最远平面的距离。在显微镜学中，景深是从近似0.2到55微米(μπι)的极短范围。应了解，当使透明样本成像时，景深内的任何物体将被成像。举例来说，使用参考6中的数据，4倍物镜具有55.5 μπι的景深，且因此当其聚焦在透明样本上且最近处于焦点对准的物平面在样本表面处时，样本的顶部55.5 μ m内的所有物体将被成像。当例如所关注区域仅是样本的顶部5 μπι时，这不合需要。因此，本领域中需要一种允许显微镜在所要深度自动聚焦在透明或半透明样本上从而视需要取消物镜的景深的其余部分的显微镜系统。本领域中需要提供允许使透明或低对比度样本在所要深度自动成像的显微镜系统和方法。
技术实现思路
本专利技术的一实施方案提供一种用于凭经验确定显微镜系统的物镜的景深的边界的方法，所述显微镜系统具有显微镜、F制光圈，以及一或多个处理器，所述方法包括以下步骤: 将样本的焦面放置在物镜的景深外部的第一位置处； 在第一位置处将F制光圈投影到焦面上以在其上产生F制光圈投影； 实行样本与物镜之间的递增相对移动以将样本的焦面相对于物镜放置在不同递增位置处，且投影F制光圈以在所述递增位置处在焦面上产生F制光圈投影，其中所述实行递增相对移动的步骤将焦面带至景深的边界处的位置； 执行第一位置处以及所述递增位置处F制光圈投影的图像的对比度分析，所述执行对比度分析的步骤由所述一或多个处理器实行且确立焦面何时处于景深的边界处的位置处。本专利技术的另一实施方案提供一种如段落中的方法，其中样本是透明的且焦面选自近焦面(相对于物镜)和远焦面(相对于物镜)。本专利技术的另一实施方案提供一种如段落或中的方法，其中景深具有第一边界WD和第二边界WD1，其中WD是焦面可距物镜的且仍处于明确焦点对准的最短距离，且WD1是焦面可距物镜的且仍处于明确焦点对准的最大距离，且第一位置经选择为小于WD的99%或大于101%的距离。本专利技术的另一实施方案提供一种如段落到的任一者中的方法，其中所述执行对比度分析的步骤通过比较多个递增位置处F制光圈投影的相对焦点的标准偏差而确立焦面何时处于景深的边界处的位置处。本专利技术的另一实施方案提供一种如段落到的任一者中的方法，其中所述投影F制光圈的步骤由所述一或多个处理器自动化。本专利技术的另一实施方案提供一种如段落到的任一者中的方法，其中所述实行递增相对移动的步骤由所述一或多个处理器自动化。本专利技术的另一实施方案提供一种如段落到的任一者中的方法，其中所述放置步骤由所述一或多个处理器自动化。本专利技术的另一实施方案提供一种如段落到的任一者中的方法，其中第一位置由显微镜系统的用户输入。本专利技术的另一实施方案提供一种如段落到的任一者中的方法，其中物镜具有制造商陈述的工作距离，且所述第一位置基于所述制造商陈述的工作距离而选择，如显微镜系统的用户所输入。本专利技术的另一实施方案提供一种如段落到的任一者中的方法，其中显微镜系统进一步包括图像传感器，且所述方法进一步包括:以电子方式利用图像传感器使F制光圈投影在所述递增位置处在焦面上成像，所述以电子方式成像的步骤由所述一或多个处理器自动化。本专利技术的另一实施方案提供一种用于使透明样本在顶部焦面下方的所界定深度处或在底部焦面上方的所界定高度处成像的方法，所述方法包括以下步骤: 凭经本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于凭经验确定显微镜系统的物镜的景深的边界的方法，所述显微镜系统具有显微镜、F制光圈，以及一或多个处理器，所述方法包括以下步骤：将样本的焦面放置在所述物镜的所述景深外部的第一位置处；在所述第一位置处将所述F制光圈投影到所述焦面上以在其上产生F制光圈投影；实行所述样本与所述物镜之间的递增相对移动以将所述样本的所述焦面相对于所述物镜放置在不同递增位置处，且投影所述F制光圈以在所述递增位置处在所述焦面上产生F制光圈投影，其中所述实行递增相对移动的步骤将所述焦面带至所述景深的所述边界处的位置；执行所述第一位置处以及所述递增位置处所述F制光圈投影的所述图像的对比度分析，所述执行对比度分析的步骤由所述一或多个处理器实行且确立所述焦面何时处于所述景深的所述边界处的位置处。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·C·普特曼，J·B·普特曼，J·S·阿彻，J·A·奥兰多，
申请(专利权)人：毫微光电子影像公司，
类型：发明
国别省市：美国;US