本发明专利技术公开了一种苜蓿褐斑病的鉴定方法，包括如下步骤：病原体分离后置于PDA培养基平台上培养，用无菌水洗涤，过滤后，得孢子悬浮液；取苜蓿的叶子，去掉叶柄，冲洗灭菌处理后，切成小块置于含有50μm/mL苯骈咪唑的0.3％水琼脂培养基上培养4天；选取生长正常状态良好的叶子平铺与培养皿上，用大头针轻轻刺伤叶面后，将所得的孢子悬浮液滴于刺伤处，在相对湿度接近100％，温度20℃，无光照的条件下，接种20h；接种结束后，转移至生长箱内培养，光强度9000lux和黑暗每12h交替一次，每天观察记录侵染及病害发展情况。本发明专利技术通过合理的培育接种方法，以及合理的培养基配方，提高了鉴定的效率，且可用于大批量的筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及苜蓿栽培领域，具体涉及。
技术介绍
苜蓿是优良的豆科牧草，种植范围广泛，褐斑病是我国苜蓿的重要病害，严重影响苜蓿的产草量和品质。鉴定和评价苜蓿对褐斑病的抗病性，是培育和利用抗病品种防治苜蓿褐斑病的基础。抗病性鉴定中最难解决的一个问题是如何提高大批量筛选的效率。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了，通过合理的培育接种方法，以及合理的培养基配方，提高了鉴定的效率，且可用于大批量的筛选。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为:—种苜蓿褐斑病的鉴定方法，包括如下步骤:S1、分别选取带典型病斑的叶片，样品表面用清水冲洗干净后在病斑的病健交界处剪取3.5mmX 3.5mm的组织块，置于无菌工作台中依次用含有0.7-1.1 %的青霉素或链霉素的去离子水浸洗4-6s，用含有0.025%的升汞和0.15?0.25%吐温混合液浸泡2?5min，用无菌水清洗5?8次，取出后用灭菌的吸水纸吸去多余的水分；S2、将所得的组织块置于培养基上，于20_30°C恒温培养箱中进行培养，36_72h后形成菌落，切取典型菌落边缘的菌丝块，转移到新的PDA平板培养基上培养，得分离物；S3、将所得的分离物在PDA培养基平台上培养7-10d后，用40?60mL无菌水洗涤，过滤后，得孢子悬浮液；S4、取苜蓿的叶子，去掉叶柄，冲洗灭菌处理后，切成小块置于含有50 μπι/mL苯骈咪唑的0.3%水琼脂培养基上培养4天；S4、选取生长正常状态良好的叶子平铺与培养皿上，用大头针轻轻刺伤叶面后，将步骤S3所得的孢子悬浮液滴于刺伤处，在相对湿度接近100%，温度20°C，无光照的条件下，接种20h ； S5、接种结束后，转移至生长箱内培养，光强度9000Iux和黑暗每12h交替一次，有光时培养温度为22°C，无光时培养温度为18°C，每天观察记录侵染及病害发展情况。其中，所述步骤S2中的培养基的配方为:稀释O?4倍的有机物、葡萄糖浓度为O?20g/L、NH4N03浓度为O?2.5g/L、pH为4.0?8.0、琼脂浓度为10?30g/L。其中，所述有机物包括盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇3mg/L、肌醇35mg/L、环己六醇 27mg/L。其中，所述步骤S2中新的PDA平板培养基包括PDA培养基的营养物质、COD及其金属离子，营养物质包括氮、磷、碳，金属离子包括铜、猛、钠、1丐、钾、镁、铁。其中，所述步骤S2中新的PDA平板培养基中还添加有营养液。其中，所述营养液配方为葡萄糖20g、蛋白胨5g、硫酸胺1.5g、磷酸二氢钾1.5g、氨基酸螯合猛50mg、硫酸锌50mg，水1000ml。本专利技术具有以下有益效果:通过合理的培育接种方法，以及合理的培养基配方，提高了鉴定的效率，且可用于大批量的筛选。【具体实施方式】为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1S1、分别选取带典型病斑的叶片，样品表面用清水冲洗干净后在病斑的病健交界处剪取3.5mmX3.5mm的组织块，置于无菌工作台中依次用含有0.7%的青霉素或链霉素的去离子水浸洗4s，用含有0.025%的升萊和0.15%吐温混合液浸泡2min，用无菌水清洗5次，取出后用灭菌的吸水纸吸去多余的水分；S2、将所得的组织块置于培养基上，于20°C恒温培养箱中进行培养，36h后形成菌落，切取典型菌落边缘的菌丝块，转移到新的PDA平板培养基上培养，得分离物；其中，所使用的培养基的配方为:盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇3mg/L、肌醇35mg/L、环己六醇27mg/L，pH为4.0?8.0、琼脂浓度为10g/L ;所使用的PDA平板培养基包括PDA培养基的营养物质、营养液、COD及其金属离子，营养物质包括氮、磷、碳，金属离子包括铜、猛、钠、1丐、钾、镁、铁，营养液配方为葡萄糖20g、蛋白胨5g、硫酸胺1.5g、磷酸二氢钾1.5g、氨基酸螯合锰50mg、硫酸锌 50mg，水 1000ml。S3、将所得的分离物在PDA培养基平台上培养7d后，用40mL无菌水洗涤，过滤后，得孢子悬浮液；S4、取苜蓿的叶子，去掉叶柄，冲洗灭菌处理后，切成小块置于含有50 μπι/mL苯骈咪唑的0.3%水琼脂培养基上培养4天；S4、选取生长正常状态良好的叶子平铺与培养皿上，用大头针轻轻刺伤叶面后，将步骤S3所得的孢子悬浮液滴于刺伤处，在相对湿度接近100%，温度20°C，无光照的条件下，接种20h ；S5、接种结束后，转移至生长箱内培养，光强度9000Iux和黑暗每12h交替一次，有光时培养温度为22°C，无光时培养温度为18°C，每天观察记录侵染及病害发展情况。实施例2S1、分别选取带典型病斑的叶片，样品表面用清水冲洗干净后在病斑的病健交界处剪取3.5mmX 3.5mm的组织块，置于无菌工作台中依次用含有1.1 %的青霉素或链霉素的去离子水浸洗6s，用含有0.025%的升汞和0.25%吐温混合液浸泡5min，用无菌水清洗8次，取出后用灭菌的吸水纸吸去多余的水分；S2、将所得的组织块置于培养基上，于30°C恒温培养箱中进行培养，72h后形成菌落，切取典型菌落边缘的菌丝块，转移到新的PDA平板培养基上培养，得分离物；其中，所使用的培养基的配方为:稀释4倍的有机物、葡萄糖浓度为20g/L、NH4N03浓度为2.5g/L、pH为8.0、琼脂浓度为30g/L ;所述有机物包括盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇3mg/L、肌醇35mg/L、环己六醇27mg/L ;所使用的PDA平板培养基包括PDA培养基的营养物质、营养液、COD及其金属离子，营养物质包括氮、磷、碳，金属离子包括铜、猛、钠、1丐、钾、镁、铁，营养液配方为葡萄糖20g、蛋白胨5g、硫酸胺1.5g、磷酸二氢钾1.5g、氨基酸螯合锰50mg、硫当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种苜蓿褐斑病的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、分别选取带典型病斑的叶片，样品表面用清水冲洗干净后在病斑的病健交界处剪取3.5mm×3.5mm的组织块，置于无菌工作台中依次用含有0.7‑1.1％的青霉素或链霉素的去离子水浸洗4‑6s，用含有0.025％的升汞和0.15～0.25％吐温混合液浸泡2～5min，用无菌水清洗5～8次，取出后用灭菌的吸水纸吸去多余的水分；S2、将所得的组织块置于培养基上，于20‑30℃恒温培养箱中进行培养，36‑72h后形成菌落，切取典型菌落边缘的菌丝块，转移到新的PDA平板培养基上培养，得分离物；S3、将所得的分离物在PDA培养基平台上培养7‑10d后，用40～60mL无菌水洗涤，过滤后，得孢子悬浮液；S4、取苜蓿的叶子，去掉叶柄，冲洗灭菌处理后，切成小块置于含有50μm/mL苯骈咪唑的0.3％水琼脂培养基上培养4天；S4、选取生长正常状态良好的叶子平铺与培养皿上，用大头针轻轻刺伤叶面后，将步骤S3所得的孢子悬浮液滴于刺伤处，在相对湿度接近100％，温度20℃，无光照的条件下，接种20h；S5、接种结束后，转移至生长箱内培养，光强度9000lux和黑暗每12h交替一次，有光时培养温度为22℃，无光时培养温度为18℃，每天观察记录侵染及病害发展情况。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘香萍，李国良，杨智明，曲善民，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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