本发明专利技术公开了一种抗牛奶且与水牛奶蛋白无交叉反应的β-酪蛋白单抗制备方法。在制备牛奶β-酪蛋白单抗的过程中，第一步是亚克隆筛选识别奶牛β-酪蛋白的细胞株；第二步是对识别奶牛β-酪蛋白的细胞株进一步筛选；第三步是筛选不识别水牛奶蛋白的细胞株，其中第三步是该抗体制备的关键。在亚克隆筛选阶段，若产生的抗体存在交叉反应，则得不到需要的细胞株，由此就无法生产所需的β-酪蛋白单克隆抗体。本发明专利技术所获得的β-酪蛋白单抗能够特异性识别奶牛β-酪蛋白而与水牛奶蛋白无交叉反应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗牛奶且与水牛奶蛋白无交叉反应的β -酪蛋白单抗制备方法，其生产的抗体可用于免疫印记和酶联免疫法检测水牛奶中是否掺假牛奶，属于食品质量安全检测领域。
技术介绍
水牛奶中总固形物、脂肪和蛋白含量均高于牛奶，奶品质优良，营养价值高，越来越受到消费者的青睐。目前，生鲜水牛奶及其奶制品的市场售价高于牛奶，这导致一些不法的生产经营者为了获取更多的经济利益，存在向水牛奶中掺假牛奶的现象。为此，国内外许多学者采用红外光谱法、毛细管电泳法、液相色谱法、质谱法等技术探索了奶掺假的研究，并找到了一些可用于掺假检测的标记分子，但因所需仪器设备昂贵、操作繁杂及费时等方面的原因，目前未能在生产中得到应用。酪蛋白是牛奶、水牛奶等反刍动物奶中主要的蛋白组分，其含量约为总蛋白含量的35%左右。酪蛋白与asl、as2和κ -酪蛋白形成胶束结构，对奶的稳定性及物理化学性质的保持具有重要作用。因此，以牛奶中酪蛋白为标记分子，用于检测奶混合物中牛奶含量，具有易于检测的特点。但是，因牛奶和水牛奶酪蛋白的氨基酸序列存在97.8%相似度，这极容易导致抗牛奶酪蛋白抗体与水牛奶酪蛋白发生交叉反应。目前，单克隆抗体制备方法虽然很成熟，但尚未有特异性抗牛奶β-酪蛋白且与水牛奶无交叉反应的抗体产品，及以β-酪蛋白抗体为基础检测水牛奶中掺假牛奶的研究报道。因此，本专利技术公开了一种抗牛奶酪蛋白而与水牛奶蛋白无交叉反应的单克隆抗体制备方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种抗牛奶且与水牛奶蛋白无交叉反应的酪蛋白单抗制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案包括以下步骤:(I)以牛奶β -酪蛋白作为抗原，定期皮下免疫Balb/c雌性小鼠；(2)加强免疫后，取血并分离血清，用ELISA方法检测血清中多抗效价；(3)选择效价达到10000以上的小鼠，分离脾脏并破碎以获取脾细胞，将脾细胞与SP2/0细胞混合，采用PEG法进行融合，然后加入小鼠胸腺细胞，用灭菌半固体培养基进行筛选培养；(4)挑选细胞单克隆，培养于用胸腺细胞铺板的细胞培养皿中；(5)采用ELISA方法第一次筛选单克隆细胞以获取抗牛奶中β -酪蛋白的细胞株，以β-酪蛋白为底物筛选阳性杂交瘤细胞株；(6)在第一次筛选的基础上，第二次采用ELISA方法进一步筛选阳性杂交瘤细胞株;(7)采用ELISA方法第三次筛选单克隆细胞以获取与水牛奶蛋白无交叉反应的细胞株，以水牛奶蛋白为底物筛选阴性杂交瘤细胞株；(8)对单克隆抗体进行鉴定，获得能分泌IgGl的杂交瘤细胞株。本专利技术的有益效果是:提供了一种抗牛奶且与水牛奶蛋白无交叉反应的β -酪蛋白单抗制备方法。该方法的第一步是亚克隆筛选识别奶牛β -酪蛋白的细胞株；第二步是对识别奶牛β -酪蛋白的细胞株进一步筛选；第三步是筛选不识别水牛奶蛋白的细胞株，第三步是该抗体制备的关键。在亚克隆筛选阶段，若产生的抗体存在交叉反应，则得不到需要的细胞株，由此就无法生产所需的酪蛋白单克隆抗体。【具体实施方式】—种抗牛奶且与水牛奶蛋白无交叉反应的β -酪蛋白单抗的制备方法，操作步骤如下:1、免疫操作步骤:选4只Balb/c雌性小鼠(编号为:1、2、3、4)进行皮下多点注射式免疫；初免剂量为60 μ g蛋白/只，每隔2周加强免疫一次，加强免疫量为30μg蛋白/只，加强免疫3-4次；取血，检测血清多抗效价。2、效价检测:实验试剂:包被液(碳酸盐缓冲液pH为9.6) ；PBS洗涤缓冲液(pH为7.4，用前加0.2%吐温20);封闭液(0.5%牛血清)；TMB显色液；终止液(2M H2SO4)。具体操作步骤如下:(I)抗原β-酪蛋白溶于生理盐水中，用包被液稀释抗原，终浓度为2 μ g/ml，100 μ I/孔，4°C包被过夜；(2)用牛血清溶液37°C封闭Ih ;(3)加抗血清及对照37°C孵育Ih ;(4)加酶标二抗，37°C孵育Ih ；(5) TMB显色液室温下反应20min ;加终止液2M H2SO4终止反应，酶标仪450nm读数。3、细胞融合实验:(I)拉颈处死小鼠，分离脾脏，将脾细胞与SP2/0细胞混合，离心移除上清，吹打充分悬浮细胞，于37°C水浴中缓慢加入Iml的PEG，静置；然后加入无血清的HffiM，离心移除上清后加入血清。(2)分离小鼠胸腺，制备胸腺细胞并转移到15ml离心管中，再加入Iml的HAT，孵育；(3)在脾细胞与SP2/0细胞混合液中加入胸腺细胞，混合均匀后加入灭菌的半固体培养基，充分混合后倒入细胞培养皿中，置于培养箱孵育。挑选细胞单克隆培养于96孔细胞培养板。4、第一次筛选单克隆细胞:用包被液稀释β -酪蛋白终浓度为2 μ g/ml，100 μ I/孔，包被酶标板，对挑选的细胞单克隆采用ELISA方法进行第一次筛选。筛选阳性杂交瘤细胞株。5、第二次筛选单克隆细胞:将第一次筛选到的细胞株进一步筛选，用包被液稀释β -酪蛋白终浓度为2 μ g/ml，100 μ I/孔，包被酶标板，筛选阳性杂交瘤细胞株。6、第三次筛选单克隆细胞:对第二步筛选到的细胞株用包被液稀释水牛奶蛋白浓度为2 μ g/ml, 100 μ I/孔，包被酶标板，对挑选的细胞单克隆采用ELISA方法进行第三次筛选。筛选阴性杂交瘤细胞株。7、小鼠腹腔注射杂交瘤细胞株，将筛选到的细胞株孵育至对数生长期时制成细胞悬液，注入小鼠腹腔诱导产生腹水，收集腹水纯化抗体。8、免疫印记验证:用考马斯亮蓝法测定牛奶和水牛奶蛋白含量，取50 μ g蛋白样品与上样缓冲液混合均匀，95°C水浴5min，室温冷却后，将蛋白样品加至预先灌制的10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，100V电泳lh。然后切胶，用夹心法220V转膜lh，将蛋白样品转移至PVDF膜。鸡血清4°C封闭过夜，酪蛋白抗体室温孵育1.5h，然后用山羊抗小鼠二抗室温孵育lh，DAB显色，结果表明，β -酪蛋白单克隆抗体仅与牛奶β -酪蛋白发生特异性反应呈现颜色，而与水牛奶蛋白无交叉反应。以上所述的本专利技术实施方式，并不构成对本专利技术保护范围的限定。任何在本专利技术的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本专利技术的权利要求保护范围之内。【主权项】1.，包括以下步骤: (1)以牛奶β-酪蛋白作为抗原，定期皮下免疫Balb/c雌性小鼠； (2)加强免疫后，取血并分离血清，用ELISA方法检测血清中多抗效价； (3)选择效价达到10000以上的小鼠，分离脾脏并破碎以获取脾细胞，将脾细胞与SP2/0细胞混合，采用PEG法进行融合，然后加入小鼠胸腺细胞，用灭菌半固体培养基进行筛选培养； (4)挑选细胞单克隆，培养于用胸腺细胞铺板的细胞培养皿中； (5)采用ELISA方法第一次筛选单克隆细胞以获取抗牛奶中β-酪蛋白的细胞株，以β-酪蛋白为底物筛选阳性杂交瘤细胞株； (6)在第一次筛选的基础上，第二次采用ELISA方法进一步筛选阳性杂交瘤细胞株； (7)采用ELISA方法第三次筛选单克隆细胞以获取与水牛奶蛋白无交叉反应的细胞株，以水牛奶蛋白为底物筛选阴性杂交瘤细胞株； (8)对单克隆抗体进行鉴定，获得能分泌IgGl的杂交瘤细胞株。【专利摘要】本专利技术公开了一种。在制备牛奶β-酪蛋白单抗的过程中，第一步是亚克隆筛选识别本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗牛奶且与水牛奶蛋白无交叉反应的β‑酪蛋白单抗制备方法，包括以下步骤：(1)以牛奶β‑酪蛋白作为抗原，定期皮下免疫Balb/c雌性小鼠；(2)加强免疫后，取血并分离血清，用ELISA方法检测血清中多抗效价；(3)选择效价达到10000以上的小鼠，分离脾脏并破碎以获取脾细胞，将脾细胞与SP2/0细胞混合，采用PEG法进行融合，然后加入小鼠胸腺细胞，用灭菌半固体培养基进行筛选培养；(4)挑选细胞单克隆，培养于用胸腺细胞铺板的细胞培养皿中；(5)采用ELISA方法第一次筛选单克隆细胞以获取抗牛奶中β‑酪蛋白的细胞株，以β‑酪蛋白为底物筛选阳性杂交瘤细胞株；(6)在第一次筛选的基础上，第二次采用ELISA方法进一步筛选阳性杂交瘤细胞株；(7)采用ELISA方法第三次筛选单克隆细胞以获取与水牛奶蛋白无交叉反应的细胞株，以水牛奶蛋白为底物筛选阴性杂交瘤细胞株；(8)对单克隆抗体进行鉴定，获得能分泌IgG1的杂交瘤细胞株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨永新，赵小伟，潘孝成，黄冬维，齐云霞，程广龙，赵辉玲，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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