生物粘合剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种生物粘合剂及其制备方法和应用，其中生物粘合剂包括Trx-Balcp19k蛋白，所述Trx-Balcp19k蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其制备方法包括反转录、扩增、构建重组质粒、转化、诱导、亲和层析、透析等步骤，本发明专利技术的生物粘合剂粘附性能强、产量相对高、制备成本低，可应用于生理材料之间、非生理材料之间、生理材料和非生理材料之间的粘附。

【技术实现步骤摘要】
生物粘合剂及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医用材料
，尤其涉及一种生物粘合剂及其制备方法和应用。
技术介绍
医用粘合剂在医疗器械等领域具有许多用途，包括人体和动物体活性组织创面的封闭修复、手术创面的封闭止血、活性生理组织间的粘合、活性生理组织与非生理材料间的粘合等。医用粘合剂按材料性质可分为化学粘合剂和生物粘合剂。化学粘合剂如a-氰基丙烯酸酯类，虽在临床应用多年，但其降解产物所产生的毒性难以避免。生物粘合剂如纤维蛋白胶，是一种医用创面封闭剂，是从人或动物血浆中提取的蛋白生物制品，主要应用于手术创面止血、促进伤口愈合、封闭缺损组织等，已在外科领域得到广泛应用，但来源于异体的人或动物血清制成的纤维蛋白胶可能激发免疫副反应，其安全性受到广泛关注，同时纤维蛋白胶粘接强度较低。因此急需开发相容性好、潮湿环境粘接强度高、可生物降解的医用粘合剂。在海洋环境中，一些成体营固着生活的无脊椎动物，例如贻贝和藤壶，它们能够分泌蛋白性的粘附剂，牢固地粘附在几乎任何水下物体表面，具有极强的粘结力、湿粘结特性和耐水性，在生物医用粘合剂、水下胶等领域具有广阔的应用前景。贻贝和藤壶代表了两种典型的水下粘附机制，前者主要是依靠存在于足丝粘附蛋白中的大量3,4-二羟基苯丙氨酸（多巴，DOPA），而后者主要依靠粘蛋白独特的氨基酸组成和高级结构。贻贝的研究由来已久，足丝粘附蛋白的提取、异源表达以及贻贝仿生粘附材料的研究取得了较大的进展。目前，美国已有BDBioscience公司从紫贻贝的足部提取到粘附蛋白并已进行商业化，名称和货号分别为BDCELL-TAKCELLANDTISSUEADHESIVE，catalogNO354240，354241。BDCell-Tak用作细胞和组织粘附剂，可以增强细胞或者组织在各种材料表面（包括塑料、玻璃、金属和各种生物材料）上的粘附。但是贻贝分泌蛋白的量很少，提取成本高且价格昂贵，很难满足需求。而通过基因工程手段表达重组的粘附蛋白存在对翻译后修饰的依赖，使得表达功能性的细菌重组贻贝粘着蛋白变得困难；仿生粘附材料因其结构的简单以及生物相容性等，难以与真正的生物胶媲美。而藤壶较贻贝在水下表面的粘附更为牢固，以致它们的个体死亡后，钙质外壳仍被紧紧粘附在基材表面，实现牢固的水下粘附。相比于贻贝，藤壶代表了另一种全新的水下粘附模型。研究表明，藤壶粘着蛋白不存在翻译后修饰现象，因而更易通过生物合成的方式获得细菌重组蛋白。日本科学家用基因工程的方法表达了红巨藤壶中的胶蛋白cp19k、cp20k，厦门大学的研究人员表达了白脊藤壶cp20k蛋白并进行了功能研究，表明cp20k能选择性地粘附在金属等基体材料表面，而cp19k在水下粘附中发挥了关键性的作用，能够粘附在水下不同物理化学特性的材料表面，但目前对白脊藤壶Balcp19k基因的克隆和表达及其粘附性能的研究未见报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种粘附能力强、产量高、制备成本低的生物粘合剂，还提供了一种制备方法简单、制备成本低的制备方法；该生物粘合剂可应用于非生理材料之间、生理材料之间、非生理材料和生理材料之间的粘结。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方法：本专利技术的一种生物粘合剂，包括Trx-Balcp19k融合蛋白，所述Trx-Balcp19k蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述的生物粘合剂，优选的，还包括溶剂。上述的生物粘合剂，优选的，生物粘合剂的溶剂为醋酸或水。进一步优选的，醋酸的体积浓度为5%～10%。上述的生物粘合剂，优选的，所述Trx-Balcp19k蛋白在所述生物粘合剂中的浓度为0.98～1.78mg/mL。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种生物粘合剂的制备方法，所述制备方法为：S1、从白脊藤壶软组织提取总RNA，反转录成第一链cDNA；S2、以步骤S1中第一链cDNA为模板，根据GenBank数据库中白脊藤壶Balcp19k基因序列设计引物进行PCR扩增得到扩增产物；S3、将所述步骤S2中得到的扩增产物连接到原核表达载体pET-32a(+)中构建重组质粒；S4、将所述步骤S3中构建的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到转化子；S5、将所述步骤S4中的转化子进行IPTG诱导表达得到表达产物；S6、将所述表达产物进行镍亲和层析纯化得到Trx-Balcp19k洗脱液；S7、将所述Trx-Balcp19k洗脱液进行透析过夜，得到Trx-Balcp19k蛋白。上述的制备方法，优选的，还包括以下步骤：将Trx-Balcp19k蛋白溶于溶剂中得到生物粘合剂。进一步的，溶剂为醋酸时：将醋酸配制成体积浓度为5%～10%的醋酸溶液，将Trx-Balcp19k蛋白溶于所述醋酸溶液中配制成生物粘合剂。进一步的，溶剂为水时：将Trx-Balcp19k蛋白溶于水中配制成生物粘合剂。上述的制备方法，优选的，所述步骤S2中设计的引物为：SEQIDNO.3所示的核苷酸序列、SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。上述的制备方法，优选的，所述步骤S6中所述亲和层析具体包括以下步骤：S6-1、将表达产物置于层析柱上用咪唑浓度为50～80mM的咪唑缓冲液（咪唑缓冲液的成分为：50～80mM咪唑、50mM磷酸氢二钠、300mM氯化钠，pH8.0）作为漂洗液漂洗层析柱，以去除非特异结合的杂蛋白；S6-2、用咪唑浓度为250～300mM的咪唑缓冲液（咪唑缓冲液的成分为：250～300mM咪唑、50mM磷酸氢二钠、300mM氯化钠，pH8.0）作为洗脱液洗脱层析柱，获得Trx-Balcp19k洗脱液。上述的制备方法，优选的，亲和层析过程中，漂洗液的体积至少为柱床体积的5倍。上述的制备方法，优选的，所述步骤S6-1中，作为漂洗液的咪唑缓冲液的流速为2.5～5ml/min。上述的制备方法，优选的，所述步骤S6-2中，作为洗脱液的咪唑缓冲液的流速为2.5～5ml/min。上述的制备方法，优选的，所述步骤S7中所述透析过程中采用的透析液为去离子水。进一步优选的，去离子水的pH为6～7。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种所述的生物粘合剂或所述制备方法制备得到的生物粘合剂在生理材料之间粘结中的应用。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种所述的生物粘合剂或所述制备方法制备得到的生物粘合剂在非生理材料之间粘结中的应用。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种所述的生物粘合剂或所述制备方法制备得到的生物粘合剂在非生理材料与生理材料之间粘结中的应用。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：（1）本专利技术提供了一种生物粘合剂，该粘合剂主要由Trx-Balcp19k融合蛋白构成，Trx-Balcp19k蛋白是由白脊藤壶Balcp19k基因经克隆、表达后纯化得到。该Trx-Balcp19k蛋白粘合剂具有粘附性能强、产量高、制备成本低等优势，适合工业化生产。（2）本专利技术提供了一种生物粘合剂的制备方法，由白脊藤壶Balcp19k基因经克隆、表达得到表达蛋白后，将表达蛋白进行亲和层析，然后在去离子水中透析得到粘性胶状物，即Trx-Balcp19k融合蛋白，经纯化后的粘性胶状物排除了其他杂蛋白的干扰，粘性更强。同时，申请人首次发现离子强度在粘性胶状物质的形本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物粘合剂，其特征在于，包括Trx‑Balcp19k蛋白，所述Trx‑Balcp19k蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种生物粘合剂的制备方法，其特征在于，所述生物粘合剂为包括Trx-Balcp19k蛋白，所述Trx-Balcp19k蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述制备方法包括以下步骤：S1、从白脊藤壶软组织提取总RNA，反转录成第一链cDNA；S2、以步骤S1中第一链cDNA为模板，根据GenBank数据库中白脊藤壶Balcp19k基因序列设计引物进行PCR扩增得到扩增产物；S3、将所述步骤S2中得到的扩增产物连接到原核表达载体pET-32a(+)中构建重组质粒；S4、将所述步骤S3中构建的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到转化子；S5、将所述步骤S4中的转化子进行IPTG诱导表达得到表达产物；S6、将所述表达产物进行镍亲和层析纯化得到Trx-Balcp19k洗脱液；S7、将所述Trx-Balcp19k洗脱液进行透析过夜，得到Trx-Balcp19k蛋白，所述透析过程中采用的透析液为去离子水。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：将Trx-Balcp19k蛋白溶于溶剂中得到生物粘合剂。3.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡碧茹，曾玲，吴文健，刘志明，李韵秋，
申请(专利权)人：中国人民解放军国防科学技术大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43