IL-4检测引物、试剂盒和半定量检测方法技术

本发明专利技术提供了一种IL-4检测引物，包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的引物P1、具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的引物P2。本发明专利技术的上述引物基于基因表达过程中编码IL-4的mRNA合成远先于分泌的IL-4蛋白产物，且蛋白质的表达量的多少与对应编码的mRNA的量成线性正比的关系；通过RT-PCR方式扩增对应编码的mRNA，再通过mRNA的量即可得到对应IL-4蛋白产物的量；其检测的不是IL-4分泌、吸附、消耗和降解后的净含量，而是IL-4产生过程中基因转录、翻译及翻译后调控机制的实时定点水平；其能更真实和准确反应细胞或组织内实时的IL-4表达水平。在上述引物的基础上，本发明专利技术还进一步提出包括上述IL-4检测引物检测试剂盒、以及利用上述引物进行半定量检测的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞因子检测
，具体涉及一种IL-4检测引物、试剂盒和半定量检测方法。
技术介绍
细胞因子是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。其中，比较重要的有IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IFN-γ、TNF-β和神经白细胞素等，在细胞间相互作用、免疫调节、造血以及炎症过程中起重要调节作用。已经有诸多的文献和研究成果表明，IL-4表达水平与多种疾病和机体免疫密切相关。通过对IL-4表达水平的检测，可以利于很多必要信息的更早获取以及相关某些疾病的早期诊断。而现有IL-4的检测中常使用免疫学测定法，比如使用率最高的ELISA试剂盒；但是现有的这些检测的试剂盒或者方法，其检测针对的是IL-4分泌、吸附、消耗和降解后的净含量，不是细胞因子产生过程中基因转录、翻译及翻译后调控机制提供必要的信息，也不能反映细胞或组织内实时的细胞因子基因表达水平，所以检测的结果不能作为IL-4指标实时定点检测真实情况。
技术实现思路
本专利技术实施的目的在于克服现有的缺陷，提供一种能更真实和准确检测细胞或组织内实时的IL-4表达水平的IL-4检测引物、试剂盒和半定量检测方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术实施例的技术方案如下：一种IL-4检测引物，包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的引物P1、具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的引物P2。基于上述检测引物，本专利技术还提出包括上述引物的IL-4检测试剂盒。本专利技术的上述引物基于基因表达过程中编码IL-4的mRNA合成远先于分泌的IL-4蛋白产物，且蛋白质的表达量的多少与对应编码的mRNA的量成线性正比的关系；通过RT-PCR方式扩增对应编码的mRNA，再通过mRNA的量即可得到对应IL-4蛋白产物的量；其检测的不是IL-4分泌、吸附、消耗和降解后的净含量，而是IL-4产生过程中基因转录、翻译及翻译后调控机制的实时定点水平；其能更真实和准确反应细胞或组织内实时的IL-4表达水平。本专利技术基于上述引物和试剂盒，进一步提出一种采用上述引物构建竞争性RT-PCR进行IL-4半定量检测方法，包括如下步骤：获取IL-4对照组细胞和IL-4待测组细胞；提取所述IL-4对照组细胞的总RNA，并用具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列的竞争性引物P3进行RT-PCR，得到竞争模板；提取所述IL-4待测组细胞的总RNA，并进行反转录获得待测cDNA模板；将所述待测cDNA模板和竞争模板混合后，用具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的引物P2进行PCR，得到靶序列扩增产物。上述方法的过程，通过引物平P1和引物P2扩增的IL-4cDNA靶片段长474bp，而用引物P1和引物P3扩增的管家基因长454bp，比靶片段短22bp；竞争模板与靶片段序列差异小，在作竞争PCR时可将影响因素降至低水平，从而使检测结果更能反映样本的真实情况；且所用的竞争模板与靶序列电泳位置接近，为判断RT-PCR产物电泳条带提供了较理想的参照物，可避免对非特异性条带的误判通过测定电泳带的密度，即可对靶序列的扩增产物进行定量，从而推知所测样本中相应mRNA的含量，更加接近真实的表达水平。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实例提出一种IL-4检测引物，包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的引物P1、具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的引物P2。本专利技术的上述检测的引物，与现有的免疫学测定法的方法和ELISA试剂盒的检测内容上不同。本专利技术的立意是基于细胞中表达蛋白质时，基因表达过程中编码IL-4的mRNA合成远先于分泌的IL-4蛋白产物，且蛋白质的表达量的多少与对应编码的mRNA的量成线性正比的关系；所以本专利技术采用上述特异性的引物通过RT-PCR方式扩增对应编码的mRNA，再通过mRNA的量即可得到对应IL-4蛋白产物的量。而且本专利技术的半定量检测引物和方法，相比现有的检测方法和试剂盒，其能具有的优势在于其检测的不是IL-4分泌、吸附、消耗和降解后的净含量，而是IL-4产生过程中基因转录、翻译及翻译后调控机制的实时定点水平；其能反应细胞或组织内实时的IL-4表达水平。在上述IL-4检测引物中含有的是一组上下游引物，其中引物P1为上游引物、而引物P2是下游引物，单一进行RT-PCR扩增，其扩增的结果在没有内参或者是对比的情况下，单个的IL-4的mRNA不方便进行准确的定量。所以在上述基础上，本专利技术的上述IL-4检测引物进一步包括具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列的竞争性引物P3。该竞争性引物P3的设计是以β-actin(肌动蛋白)的基因设计的引物，其中需要进一步仔细的说明的是β-actin基因是属于管家基因，在哺乳动物细胞表达中是由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，且其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，可以作为半定量中的比对参照物。在进行半定量RT-PCR时，选择管家基因可以通过计算目的基因和内参的比值，得到基因表达的相对浓度，从而辅助判断RT-PCR的整个体系和反应条件是否合适，以及PCR的结果情况。通过该竞争性引物P3的引物与上述引物P1共同组成引物对，同时扩增IL-4基因片段(即靶序列)和β-actin基因片段(内参序列)，扩增过程中靶序列和竞争性序列均用相同的引物对以相同的效率扩增，两序列的初始化比值在整个反应过程中保持不变，得到竞争性的cDNA模板。然后再以该竞争性的cDNA模板分别用IL-4引物对和β-actin引物对进行单独扩增；通过β-actin蛋白mRNA扩增产量(扩增过程中β-actin的引物可以自行设计，或者采用本专利技术下述设计的引物P4和P5)的结果，即可作为相对确定IL-4的mRNA表达水平的对照，便于本专利技术IL-4检测中的定量分析。进一步在上述检测的引物的基础上，为了便于竞争性RT-PCR中β-actin蛋白mRNA量的检测，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种IL‑4检测引物，其特征在于，包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的引物P1、具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的引物P2。

【技术特征摘要】
1.一种IL-4检测引物，其特征在于，包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序
列的引物P1、具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的引物P2。
2.如权利要求1所述的IL-4检测引物，其特征在于，还包括具有序列表
SEQ.ID.No.3碱基序列的竞争性引物P3。
3.一种IL-4检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的IL-4
检测引物。
4.如权利要求3所述的IL-4检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括
具有序列表SEQ.ID.No.4碱基序列的引物P4、具有序列表SEQ.ID.No.5碱基序
列的引物P5。
5.如权利要求3或4所述的IL-4检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还
包括RNase抑制剂，且该RNase抑制剂为焦碳酸二乙酯。
6.如权利要求3或4所述的IL-4检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还
包括PMA和/或钙离子载体。
7.一种IL-4半定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取IL-4对照组细胞和IL-4待测组细胞；
提取所述IL-4对照组细胞的总RNA，并用具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序
列的引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.3碱基...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，鲁菲，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44