用于生物合成白藜芦醇的融合基因、表达载体及制备方法技术

本发明专利技术公开了用于生物合成白藜芦醇的融合基因、表达载体及制备方法，采取合适的引物对4CL和RS基因进行连接，能够使得4CL和RS酶蛋白各自保留活性，同时又能提高总酶促反应效率。并且还对生物合成白藜芦醇的发酵工艺条件如培养及种类、添加底物浓度、发酵温度、发酵时间以及诱导剂浓度等方面进行进一步优化，使得目标产物白藜芦醇的产量和摩尔转化率都较高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于生物合成白藜芦醇的融合基因、蛋白、表达载体及应用，具体属于基因工程领域。
技术介绍
白藜芦醇是植物在受到外界逆境刺激时产生的一种植物保护素，常见的植物生长逆境有紫外线辐射、真菌感染以及机械损伤等，而白藜芦醇是少数几种高等植物受到真菌感染、损伤及紫外线辐射时产生的一种植保素，是一种非常重要的次级代谢产物。作为红葡萄酒的有效成分，它可预防多种疾病，如抗凝血、抗氧化、抗炎免疫、抗癌、心血管保护和神经保护等作用。因此，白藜芦醇被誉为继紫杉醇之后又一新的绿色抗癌药物。然而，一般植物中白藜芦醇的含量都比较低，难以满足市场的需求。生物合成白藜芦醇是目前的研究热点，该法不仅可以克服植提法所面临的生态破坏与资源匮乏问题，也可以解决化学合成法所带来的环境污染问题。融合基因技术是将两个或多个表达不同功能蛋白的基因通过分子生物学的手段连接起来，从而能够编码出具有多个功能的复合蛋白。在每个蛋白之间都需要一个起过渡连接作用的柔性氨基酸链(linker)，这样使得最终得到的融合蛋白不仅具有所有蛋白酶的活性，而且还能够增加总酶促反应速率。研究表明，在构建融合基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生物合成白藜芦醇的融合基因，其特征在于，它是由拟南芥的对香豆酰辅酶A连接酶基因与花生的白藜芦醇合酶基因融合得到的4CL：：RS融合基因，是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于生物合成白藜芦醇的融合基因，其特征在于，它是由拟南芥的对香豆酰辅酶
A连接酶基因与花生的白藜芦醇合酶基因融合得到的4CL：：RS融合基因，是SEQIDNO.1所
示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的用于生物合成白藜芦醇的融合基因编码的蛋白质，其特征在于，它
是SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。
3.一种含有权利要求1所述融合基因的表达载体pET-30a/4CL：：RS。
4.如权利要求1～3任一项所述的融合基因的制备及表达方法，其特征在于，首先在大肠
杆菌中克隆拟南芥4CL基因与花生RS基因，通过基因融合技术将4CL基因与花生RS基因
融合起来，选择大肠杆菌作为宿主菌株，实现4CL：：RS融合基因在原核中的表达；所述的基
因融合技术采用的是长度为15个氨基酸的柔性Linker，其氨基酸序列为(GGGGS)3，并将
其对应的核苷酸序列设计为ggtggaggcggatccggcggaggtggctctggcggtggcggatcg，所述划
线序列为BamHI酶切位点，通过多步PCR反应、BamHI单酶切反应以及连接反应，构建
融合基因4CL：：RS，随后，通过NcoI与EcoRI酶切位点构建原核表达载体pET-30a/4CL：：RS，
在28℃诱导表达8h，分别通过ProteinIsoTMNi-NTAResin纯化及Westernblot分析验证所构
建的原核表达载体pET-30a/4CL：：RS能够表达目的融合基因4CL：：RS，即所得到的重组菌株
BL21(DE3)携带重组质粒pET-30a/4CL：：RS；
所采用的引物分成两条设计，4CL：：RS-F1和4CL：：RS-R1为第一个基因4CL的上、下游引
物，4CL：：RS-F1中引入了NcoI酶切位点CCATGG，4CL：：RS-R1在引入BamHI酶切位点的
同时又将4CL基因的终止密码子TAG敲除；4CL：：RS-F21、4CL：：RS-F22、4CL：：RS-R2为第二
个基因(RS)的上、下游引物引物，4CL：：RS-F22在引入BamHI酶切位点的同时又将RS基
因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭雪峰，张二浩，王进，孙嘏，姚曦，荀航，
申请(专利权)人：国际竹藤中心，
类型：发明
国别省市：北京;11