本发明专利技术公开了一种用于双表位展示的噬菌体载体及其构建方法。本发明专利技术所提供的用于双表位展示的噬菌体载体，为含有源自丝状噬菌体的用于展示外源肽的pⅢ蛋白和pⅧ蛋白的编码基因的环形载体。本发明专利技术首次将噬菌体pⅢ展示系统和pⅧ展示系统整合到一起，形成了噬菌体pⅢ和pⅧ双表位展示系统，可以在同一噬菌体的pⅢ蛋白和pⅧ蛋白上展示不同的外源多肽，从而丰富了噬菌体展示系统的种类，并为其生物学和医学应用提供了新的工具和方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种用于双表位展示的噬菌体载体及其构建方 法。
技术介绍
噬菌体展示技术就是指以噬菌体为载体，将外源基因插入到噬菌体的基因组中， 并伴随着噬菌体基因组的表达而表达，在噬菌体自我组装时，外源基因所表达的蛋白或多 肽作为外壳蛋白的一部分，以融合蛋白的形式被展示到噬菌体的表面。 自1985年Gorge P. Smith首次提出嗤菌体展示以来，嗤菌体展示技术已经得到了 广泛应用，并形成了多种噬菌体展示系统，包括PIII展示系统、p VID展示系统和p VI展示系统 等。PlII蛋白是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，由于pill蛋白的拷贝数较少，所 以特异性较强，在文库筛选时就能得到亲和力较高的多肽或噬菌体。而P VID蛋白是丝状噬 菌体的主要外壳蛋白，位于噬菌体背部，约有2700个左右的拷贝，能够大量展示外源多肽， 但是不能展示过长的片段，否则会影响噬菌体的组装。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于双表位展示的噬菌体载体。 本专利技术所提供的用于双表位展示的噬菌体载体，为含有源自丝状噬菌体的用于展 示外源肽1的P III蛋白和用于展示外源肽2的P VDI蛋白的编码基因的环形载体。 其中，所述外源肽1和所述外源肽2既可为不同外源肽，也可为相同外源肽。 在本专利技术中，所述P III蛋白的编码基因源自噬菌体载体fUSE55 ;所述P VID蛋白的 编码基因源自噬菌体载体f88-4。 进一步，所述PIII蛋白的编码基因为序列表中序列1的第1589-2876位；所述P VID 蛋白的编码基因为序列表中序列1的第5771-6001位。 更加具体的，本专利技术所提供的所述用于双表位展示的噬菌体载体的序列为序列表 中序列1。 本专利技术的另一个目的是提供一种制备所述用于双表位展示的噬菌体载体的方法。 本专利技术所提供的制备所述用于双表位展示的噬菌体载体的方法，具体可包括如下 步骤： (1)以噬菌体载体f88_4为模板，采用引物1和引物2进行PCR扩增，得到PCR产 物(含有用于展示外源肽的P W蛋白的编码基因）； 所述引物1为根据所述噬菌体载体f88-4上酶切位点Msc I上游的序列设计的正 向引物；所述引物2为根据所述菌体载体f88-4上酶切位点Sac II下游的序列设计的反向 引物； (2)用限制性内切酶Msc I和Sac II双酶切步骤（1)所得PCR产物，将酶切产物 胶回收后与经过限制性内切酶Msc I和Sac II双酶切的噬菌体载体fUSE55的骨架片段相 连，得到所述用于双表位展示的噬菌体载体。 更加具体的，在本专利技术中，所述引物1为序列表中序列2所示单链DNA分子；所述 引物2为序列表中序列3所示单链DNA分子。 所述用于双表位展示的噬菌体载体在展示两种不同外源肽中的应用也属于本发 明的保护范围。 在所述应用中，所述两种不同外源肽分别直接融合于所述P III蛋白的氨基末端以 及所述P VID蛋白的氨基末端。 本专利技术的又一个目的是提供一种利用所述用于双表位展示的噬菌体载体展示两 种不同外源肽的方法。 本专利技术所提供的利用所述用于双表位展示的噬菌体载体展示两种不同外源肽的 方法，具体可包括如下步骤： (a)将所述两种不同外源肽的编码基因分别插入到所述P III蛋白的编码基因的两 个酶切位点Bgl I之间，以及所述P VID蛋白的编码基因的酶切位点Pst I和Hind III之间， 得到重组噬菌体载体； (b)利用步骤（a)得到的所述重组噬菌体载体包装得到重组噬菌体；所述重组噬 菌体上展示所述两种不同外源肽，且所述两种不同外源肽分别直接融合于所述P III蛋白的 氨基末端以及所述P VID蛋白的氨基末端。 在本专利技术中，以上所有的所述外源肽（即所述外源肽1和/或所述外源肽2)均可 为金纳米颗粒结合多肽GBP和/或P53结合蛋白多肽PBP。 所述金纳米颗粒结合多肽GBP的氨基酸序列如序列表中序列4所示；所述P53结 合蛋白多肽PBP的氨基酸序列如序列表中序列5所示。在基因水平上，所述金纳米颗粒结 合多肽GBP的编码基因如序列表中序列6的第6-29位所示；所述P53结合蛋白多肽PBP的 编码基因如序列表中序列7的第3-47位所示。 利用所述方法制备得到的重组噬菌体也属于本专利技术的保护范围。 本专利技术首次将噬菌体p III展示系统和p VID展示系统整合到一起，形成了噬菌体p III和p VID双表位展示系统，可以在同一噬菌体的p III蛋白和p VID蛋白上展示不同的外源多 肽，从而丰富了噬菌体展示系统的种类，并为其生物学和医学应用提供了新的工具和方法。【附图说明】 图1为噬菌体载体f88_4和噬菌体载体fUSE55的图谱。其中，A为噬菌体载体 f88-4 ;B为噬菌体载体fUSE55。 图2为引物f88s和f88a在噬菌体载体f88_4上的位置，以及酶切位点Msc I和 Sac II的位置。 图3为以噬菌体载体f88_4为模板，用引物f88a和f88s进行PCR扩增的结果。1， Marker DL2000 ;2, 3 :PCR 产物。 图4为噬菌体载体fUSE55的Msc I和Sac II双酶切电泳图。1，marker， Trans2000;2，未经酶切的噬菌体载体fUSE55;3，MscI单酶切验证；4，SacII单酶切验证 ； 5, Msc I和Sac II双酶切。 图5为实施例1构建得到的用于双表位展示的噬菌体载体的图谱。 图6为重组噬菌体的SDS-PAGE电泳结果。1，重组噬菌体；2,野生型噬菌体。 图7为重组噬菌体的Western Blot检测结果。1，重组噬菌体；2,野生型噬菌体。【具体实施方式】 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 嗤菌体载体 f88_4 (A filamentous phage vector called f88_4):记 载于 "Zhong, G.，Smith, G. Ρ·，Berry, J.，Brunham, R. C.，Conformational mimicry of a chlamydial neutralization epitope on filamentous phage.J Biol Cheml994, 269(39)，24183-24188. " 一文中，由 George P. Smith 实验室捐赠。噬菌体载体 f88-4由野生型噬菌体（fd丝状噬菌体）衍生而来，用于噬菌体的p VDI展示，其噬菌体基因 组全长为9234bp，含有两种p VDI蛋白编码基因，一种是野生型，一种是重组型(见图1 )，所以 其表达的噬菌体P VID蛋白是杂合的，重组型的P VID蛋白上用于展示外源多肽。 嗤菌体载体 fUSE55 (The fUSE5vector):记载于^⑶!:!:，】· K. ; Smith, G. P. , Searching for peptide ligands with an epitope library. Sciencel990, 249(4967)，386-390. " 一文中，由 George P. Smith 实本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于双表位展示的噬菌体载体，为含有源自丝状噬菌体的用于展示外源肽1的pⅢ蛋白和用于展示外源肽2的pⅧ蛋白的编码基因的环形载体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王丽，鞠志刚，高翔，
申请(专利权)人：东北师范大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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