一种基于化学衍生的磷脂分类检测和定量方法技术

本发明专利技术公开一种基于化学衍生的磷脂分类检测和定量方法，属于磷脂定量检测方法技术领域。其应用三甲基硅重氮甲烷对待测样本中磷脂分子中的磷酸基团进行甲酯化衍生；电离样本中经过甲酯化衍生的磷脂分子，产生若干种待质谱检测的离子；在相应的待质谱检测的离子的选择上，根据不同磷脂种类选择加合H+或者NH4+的离子；根据不同种类离子的质谱裂解规律设定不同的中性丢失或者前体离子扫描模式，得到不同种类离子的质谱离子型号的量；最后，通过与内标比较及运算，得到样本中不同种类磷脂分子的量。该方法检测速度快，灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
一种基于化学衍生的磷脂分类检测和定量方法
本专利技术涉及磷脂定量检测方法
，特别是涉及一种基于化学衍生的磷脂分类检测和定量方法。
技术介绍
磷脂不仅是细胞膜的重要组成成分，也广泛参与调节多种生命活动过程，包括能量转换、物质运输、信息识别与传递、细胞发育和分化，以及细胞凋亡等。磷脂的异常代谢与动脉硬化症、糖尿病、肥胖症、Alzheimer病以及肿瘤发生也密切相关。因此，从“组学”的角度出发，系统性、规模性地研究磷脂分子在不同生理或病理状态下组成及相对量的动态变化分析，对揭示磷脂代谢与细胞、器官乃至机体的生理、病理过程之间的关系及其分子机理，进而发掘与疾病发生相关的重要生物标记物，促进疾病的早期诊断和治疗具有重要的意义。目前，随着质谱离子化技术，特别是电喷雾离子化(electrosprayionization,ESI)和基质辅助激光解吸离子化(matrixassistedlaserdesorption/ionization,MALDI)等适合于生物大分子的离子化技术的发展，基于生物质谱的磷脂鉴定和定量分析技术因其高灵敏度、高分辨率、高准确性和高通量性等特点，已经成为磷脂组学研究的主要工具。磷脂类脂质分子均可利用ESI-MS进行分析，但不同种类的磷脂分子因自身结构(主要是极性头部)及溶液组成的差异具有不同的离子化倾向。磷脂酰胆碱(PtdCho)类脂质分子在中性或碱性pH条件下呈电中性，电离后倾向于形成加合H+的正离子。尽管在含有醋酸根的溶液和加大电压的情况下，PtdCho也可以形成[M-CH3COO]-形式的阴离子，但信号比较低。磷脂酰乙醇胺类脂质分子(PtdEtn)由于含有乙醇胺极性头部，在碱性pH条件下，季胺基容易去质子化而携带一个净负电荷。酸性磷脂类脂质，包括磷脂酸(PtdH)，磷脂酰甘油(PtdGro)、磷脂酰丝氨酸(PtdSer),磷脂酰肌醇(PtdIns)，在生理pH条件下携带一个或多个净负电荷，在质谱检测时主要以负离子的形式存在。因此，通常情况下，PtdCho用正离子模式检测，而PtdEtn、PtdH、PtdGro、PtdSer和PtdIns则用负离子进行检测，从而导致在利用ESI-MS对生物样本中的磷脂组进行定性和定量分析时要结合正离子和负离子模式，从而导致分析时间的增长。同时，在负离子模式下，部分磷脂的检测灵敏度相对较低。另一方面，为进一步发掘与不同生理、病理过程相关的重要磷脂分子及其作用机理，需要对磷脂组在不同生理或病理状态下的相对量的变化进行分析。很多传统的研究利用放射性标记(如3H-，14C-或32P-标记的碳源或磷脂头部基团)或荧光标记(如7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl，NBD)的前体，选择性(某一脂类特异性前体，如肌醇)或非选择性(如脂类共同的前体)代谢性标记组织或细胞中的磷脂，从而达到定量的目的，但这些方法比较繁琐，而且费时费力，基于ESI/MS的定量分析技术因其高分辨率、高准确性等特点，越来越多地应用于细胞脂质组的定量分析。在优化的条件下(比如pmol/mL或更低的浓度条件下)，磷脂质谱信号强度与磷脂浓度呈线性关系且相同种类磷脂分子的离子化效率基本一致，与脂肪酸链的物理性质无关。因此，在正离子和负离子模式中，通过加入特定磷脂种类的内标，可对生物样本中的磷脂进行定量。Clark等(参见Clark,J.，etal.NatMethods.2011,8,267-72.)报道了利用三甲基硅重氮甲烷(TMS-diazomethane)甲酯化磷脂酰肌醇磷酸(PIPs)的磷酸基团可大大提高磷脂酰肌醇磷酸的检测灵敏度，提示利用TMS-diazomethane可使磷酸基团甲酯化，并具有应用于磷脂检测和定量的潜在可能性。尽管如此，将基于三甲基硅重氮甲烷(TMS-diazomethane)的磷酸甲酯化应用于磷脂的检测仍有诸多问题尚待解答。首先，由于磷脂种类和结构的复杂性，基于三甲基硅重氮甲烷(TMS-diazomethane)的磷酸甲酯化是否能够应用于磷脂(包括溶血性磷脂)的检测尚不清楚，也未见相关的报道。其次，基于三甲基硅重氮甲烷(TMS-diazomethane)的磷酸甲酯化的衍生化效率是否受到磷脂分子的物理或化学性质的影响，诸如磷脂分子的脂肪酸链长度、脂肪酸链的饱和度等，亦尚不清楚。第三，甲酯化衍生的磷脂分子如何利用质谱进行检测和定量也不明了。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种应用三甲基硅重氮甲烷对样本中磷脂分子中的磷酸基团进行甲酯化衍生，并利用质谱，对待测样本中不同种类磷脂分子的量进行定量的基于化学衍生的磷脂分类检测和定量方法。为了达到上述目的，本专利技术主要提供如下技术方案：本专利技术提供的基于化学衍生的磷脂分类检测和定量方法包括以下步骤：步骤1：从待检测样本中提取待检测磷脂；步骤2：应用三甲基硅重氮甲烷对样本中的磷脂分子中的磷酸基团进行甲酯化衍生，降低磷脂分子的电负性；步骤3：电离样本中经过甲酯化衍生的磷脂分子，产生若干种待质谱检测的离子，所述待检测的离子种类包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血性磷脂酰胆碱、溶血性磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰丝氨酸、溶血性磷脂酸、溶血性磷脂酰甘油、溶血性磷脂酰肌醇；步骤4：在所述磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、溶血性磷脂酰胆碱、溶血性磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰丝氨酸、溶血性磷脂酸、溶血性磷脂酰甘油、溶血性磷脂酰肌醇上，分别选取加合H+的离子；在磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇上，分别选取加合NH4+的离子；根据所述步骤3中不同种类离子的质谱裂解规律，设定不同的中性丢失或前体离子扫描模式，利用质谱对所述步骤3中不同种类离子进行分类检测，得到所述步骤3中不同种类离子的质谱离子信号的量；步骤5：通过与内标比较，将所述步骤4得到的所述步骤3中不同种类离子的质谱离子信号的量关联于样本中磷脂分子的量，得到样本中不同种类磷脂分子的量。本专利技术的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。作为优选，利用质谱对所述步骤3中不同种类离子进行分类检测时，选用液相色谱-质谱联用的方式检测，或者，选用直接进样-质谱联用的方式检测。作为优选，所述步骤1是在甲基叔丁基醚/甲醇/水溶液体系中进行的，所述甲基叔丁基醚/甲醇/水溶液体系中，甲基叔丁基醚、甲醇、水的体积比为10∶3∶2.5。作为优选，所述步骤2是在甲基叔丁基醚/甲醇/1N盐酸溶液体系中进行的，所述甲基叔丁基醚/甲醇/1N盐酸溶液体系中，甲基叔丁基醚、甲醇、1N盐酸的体积比为300∶90∶4。作为优选，所述步骤3是在氯仿/甲醇/醋酸铵溶液体系中进行的，所述氯仿/甲醇/醋酸铵溶液体系中，所述醋酸铵的浓度为5～10mM，所述氯仿、甲醇的体积比为(1～2)∶1。作为优选，所述磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、溶血性磷脂酸、溶血性磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰甘油、溶血性磷脂酰丝氨酸、溶血性磷脂酰肌醇利用中性丢失扫描进行检测和定量。作为优选，利用中性丢失扫描对所述磷脂酸进行检测和定量时，中性丢失为143Da(126Da+NH3)；利用中性丢失扫描对所述磷脂酰乙醇胺进行检测和定量时，中性丢失为155Da；利用中性丢失本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于化学衍生的磷脂分类检测和定量方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：从待检测样本中提取待检测磷脂；步骤2：应用三甲基硅重氮甲烷对样本中的磷脂分子中的磷酸基团进行甲酯化衍生，降低磷脂分子的电负性；步骤3：电离样本中经过甲酯化衍生的磷脂分子，产生若干种待质谱检测的离子，所述待检测的离子种类包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血性磷脂酰胆碱、溶血性磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰丝氨酸、溶血性磷脂酸、溶血性磷脂酰甘油、溶血性磷脂酰肌醇；步骤4：在所述磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、溶血性磷脂酰胆碱、溶血性磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰丝氨酸、溶血性磷脂酸、溶血性磷脂酰甘油、溶血性磷脂酰肌醇上，分别选取加合H+的离子；在磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇上，分别选取加合NH4+的离子；根据所述步骤3中不同种类离子的质谱裂解规律，设定不同的中性丢失或前体离子扫描模式，利用质谱对所述步骤3中不同种类离子进行分类检测，得到所述步骤3中不同种类离子的质谱离子信号的量；步骤5：通过与内标比较，将所述步骤4得到的所述步骤3中不同种类离子的质谱离子信号的量关联于样本中磷脂分子的量，得到样本中不同种类磷脂分子的量。...

【技术特征摘要】
1.一种基于化学衍生的磷脂分类检测和定量方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：从待检测样本中提取待检测磷脂；步骤2：应用三甲基硅重氮甲烷对样本中的磷脂分子中的磷酸基团进行甲酯化衍生，降低磷脂分子的电负性；步骤3：电离样本中经过甲酯化衍生的磷脂分子，产生若干种待质谱检测的离子，所述待检测的离子种类包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血性磷脂酰胆碱、溶血性磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰丝氨酸、溶血性磷脂酸、溶血性磷脂酰甘油、溶血性磷脂酰肌醇；步骤4：在所述磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、溶血性磷脂酰胆碱、溶血性磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰丝氨酸、溶血性磷脂酸、溶血性磷脂酰甘油、溶血性磷脂酰肌醇上，分别选取加合H+的离子；在磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇上，分别选取加合NH4+的离子；根据所述步骤3中不同种类离子的质谱裂解规律，设定不同的中性丢失或前体离子扫描模式，利用质谱对所述步骤3中不同种类离子进行分类检测，得到所述步骤3中不同种类离子的质谱离子信号的量；步骤5：通过与内标比较，将所述步骤4得到的所述步骤3中不同种类离子的质谱离子信号的量关联于样本中磷脂分子的量，得到样本中不同种类磷脂分子的量；其中，所述步骤3，电离利用配备有自动纳喷离子源直接进样系统，纳喷柱的内径为5.5μm；参数如下:a)正离子模式，离子化电压为1.25kV；b)气体背压为0.5psi；c)将预先润洗端头和吸取样品后继续吸1μL空气的参数设定为开启，以防止端头中的样品在机械臂移动过程中流出；质谱系统的参数如下：a)离子传输管的温度为190℃，S透镜的高频振幅为217；b)中性丢失或前体离子扫描的碰撞能为40eV,驻留时间为500ms，质谱分辨率为1Da；c)每个中性丢失或前体离子扫描采集3min；d)质谱质量范围设定为m/z400-1200；所述步骤4，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸主要形成加合H+的离子；磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇主要形成加合NH4+的离子。2.根据权利要求1所述的基于化学衍生的磷脂分类检测和定量方法，其特征在于，所述步骤1是在甲基叔丁基醚/甲醇/水溶液体系中进行的，所述甲基叔丁基醚/甲醇/水溶液体系中，甲基叔丁基醚、甲醇、水的体积比为10∶3∶2.5。3.根据权利要求1所述的基于化学衍生的磷脂分类检测和定量方法，其特征在于，所述步骤2是在甲基叔丁基醚/甲醇/1N盐酸溶液体系中进行的，所述甲基叔丁基醚/甲醇/1N盐酸溶液体系中，甲基叔丁基醚、甲醇、1N盐酸的体积比为300∶90∶4。4.根据权利要求1所述的基于化学衍生的磷脂分类检测和定量方法，其特征在于，所述步骤3是在氯仿/甲醇/醋酸铵溶液体系中进行的，所述氯仿/甲醇/醋酸铵溶液体系中，所述醋酸铵的浓度为5～10mM，所述氯仿、甲醇的体积比为(1～2)∶1。5.根据权利要求1所述的基于化学衍生的磷脂分类检测和定量方法，其特征在于，所述磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、溶血性磷脂酸、溶血性磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰甘油、溶血性磷脂酰丝氨酸、溶血性磷脂酰肌醇利用中性丢失扫描进行检测和定量。6.根据权利要求5所述的基于化学衍生的磷脂分类检测和定量方法，其特征在于，利用中性丢失扫描对所述磷脂酸进行检测和定量时，中性丢失为143Da；利用中性丢失扫描对所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡潭溪，杨福全，舒清博，郭晓静，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11