一种快速无损检测小球藻胞内虾青素的方法技术

本发明专利技术提供一种快速无损检测小球藻胞内虾青素的方法，包括步骤：1)用去离子水或磷酸盐缓冲液重悬从小球藻悬浮液已知样品中收集到的藻细胞，调整为细胞密度在6×105～2×106CFU/mL的重悬液，用流式细胞仪检测藻细胞重悬液在FL1通道或FL2通道的平均荧光强度；将小球藻悬浮液已知样品的虾青素含量的对数值和相应测得的FL1或FL2通道的平均荧光强度值的对数值作线性回归，得标准曲线；2)制备待测样品—用去离子水或磷酸盐缓冲液重悬从待测小球藻悬浮液中收集到的藻细胞，调整为细胞密度在6×105～2×106CFU/mL的待测藻细胞重悬液；3)用流式细胞仪检测待测样品在FL1通道或FL2通道的平均荧光强度，根据步骤1)的标准曲线，算得其虾青素含量。本发明专利技术的方法具有检测效率高的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微藻胞内色素的快速无损检测技术，特别设及一种基于巧光检测技术 的小球藻胞内邮青素的快速无损检测方法。
技术介绍
邮青素（astaxanthin)被称为"超级抗氧化剂"，抗氧化能力是其它类胡萝h素如 0 -胡萝h素、玉米黄素、叶黄素和角黄素等的10倍多，具有清除自由基、阻止脂质过氧化 能力，在预防动脉硬化、帕金森综合症、视网膜黄斑变性等年龄相关性疾病方面具有重要作 用，对于维护眼睛和中枢神经系统健康，增强免疫系统功能、强化肌体能量代谢、抗癌、抗感 染等具有多重功效。目前利用雨生红球藻生产天然邮青素是最主要的生产方法，但面临着成本高、生 产效率低且不稳定、易生物污染等技术瓶颈的制约。小球藻C.zofingiensis是一种单细胞 绿藻，细胞直径为2-15ym，在高光、低氮诱导条件下可W显著提高胞内邮青素含量，是生产 天然邮青素的一种重要的替代性微藻种质。近年来研究表明，小球藻C.zofingiensis能够 在黑暗条件下利用有机物进行异养高密度发酵，经高光、高温、高盐、氮磯限制等诱导条件 能高效积累邮青素。因此，开发针对小球藻C.zofingiensis胞内色素尤其是邮青素进行检 测分析的技术，对于采用小球藻生产邮青素等类胡萝h素具有重要意义。 目前分析测定邮青素的传统方法是紫外-可见分光光度计法扣V-vis)、高效液相 色谱法0PLC)等。但该两种方法其检测效率还不够理想，需要对藻细胞中的邮青素事先 提取，而后针对提取物来检测邮青素含量，该样不仅增加了检测所需工序，而且所需时间较 长，降低了工作效率。 开发一种可提高检测效率、简化检测工序的小球藻邮青素检测方法非常有必要。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种快速无损检测小球藻胞内 邮青素的方法。 本专利技术为达到其目的，采用的技术方案如下：[000引一种快速无损检测小球藻胞内邮青素的方法，包括如下步骤： 1)建立标准曲线---取多个邮青素含量已知的小球藻悬浮液已知样品，用去离子 水或磯酸盐缓冲液重悬从所述小球藻悬浮液已知样品中收集到的藻细胞，调整为细胞密度 在6X105~2X10 6CFU/mL(个/mL)之间的藻细胞重悬液，用配备有488皿氣离子激光器的 流式细胞仪检测藻细胞重悬液在FL1通道巧33/30nm带通滤片）或FL2通道巧85/40nm带 通滤片）的平均巧光强度值；将小球藻悬浮液已知样品的邮青素含量的对数值和相应测得 的FL1或FL2通道的平均巧光强度值的对数值作线性回归，得标准曲线；所述多个邮青素含 量已知的小球藻悬浮液已知样品之间的邮青素含量不同。 2)制备及检测待测样品---用去离子水或磯酸盐缓冲液重悬从待测小球藻悬浮 液中收集到的藻细胞，调整为细胞密度在6X1〇5~2X10 6cFU/mL(个/mL)之间的待测藻细 胞重悬液，作为待测样品； 3)用配备有488nm氣离子激光器的流式细胞仪检测待测样品在化1通道或FL2通 道的平均巧光强度值，根据步骤1)建立的标准曲线，算得待测样品的邮青素含量。 优选的，用流式细胞仪检测样品时，其进样流速控制为14~100yL/min。[001引更为优选的，进样流速控制为35yL/min。 进一步的，所述磯酸盐缓冲液的浓度为lOmM，抑为6. 8~7. 6。 优选的，样品在用流式细胞仪检测前还具有用孔径5~40ym的水相滤膜或有机 相滤膜过滤的步骤；所述对数值为W10为底的对数。 进一步的，步骤1)中所述已知样品的邮青素含量通过HPLC法或紫外-可见分光 光度计法测得，可W采用本
现有的HPLC法或紫外-可见分光光度计法或其他方法 测得。 优选的，步骤1)中所述已知样品的邮青素含量通过HPLC法测得，测定步骤包括：[001引 a、HPLC法待测样品制备---将小球藻悬浮液已知样品冻干为藻粉，从藻粉中提取 获得邮青素提取物，用甲醇和MTBE(甲基叔了基離）按照1:3~7:3的体积比混合的溶剂 溶解所述邮青素提取物； b、HPLC法检测条件---采用液相色谱仪检测样品，检测波长为480nm，所用色谱柱 为YMC?C30 ;甲醇、甲基叔了基離和水分别为流动相A、B、C，W流动相A、B、C组成的洗脱液 进行梯度洗脱，流动相梯度洗脱程序及各流动相的体积百分比为： 0-6min，流动相A95%- 80%、流动相B5 - 20%、流动相C0% ; 6-12min，流动相A80 - 60%、流动相B20 - 38%、流动相C0 - 2% ; 12-28min，流动相A60 - 50%、流动相B38 - 48%、流动相C2% ; 28-33min，流动相A50%、流动相B48%、流动相C2%; 33-35min，流动相A50 - 95%、流动相B48 - 5%、流动相C2 - 0%; 35-38min，流动相A95%、流动相B5%、流动相C0%; C、建立HPLC法标准曲线---用甲醇和MT邸按照1:3~7:3的体积比混合的溶 剂配制邮青素标准品溶液，对多个浓度梯度的标准品溶液按照步骤b的检测条件检测各浓 度的标准品溶液的液相峰面积，将液相峰面积和相应的标准品溶液浓度做线性回归，绘制 HPLC法标准曲线；t步骤a中制得的样品经步骤b检测得到液相峰面积，然后根据步骤C建立的 HPLC法标准曲线，算得所述已知样品的邮青素含量。[002引优选的，步骤b中，用液相色谱仪检测时，柱温箱温度为25~35°C，洗脱液流速 控制为0. 5~1. 5血/min;所述液相色谱仪还配备有PDA检测器，在检测时，PDA检测器在 480nm对邮青素进行检测，同时在300~700nm对样品进行全波长扫描。优选的，步骤a中，邮青素提取物通过如下步骤获得：将藻粉加入混合溶剂中，振 荡，置于液氮中冷却，离屯、收集上清液；沉淀再次加入所述混合溶剂中，振荡，置于液氮中冷 却，离屯、收集上清液，重复该步骤直至藻细胞呈无色为止；合并所有上清液，用氮气吹干； 所述混合溶剂为含有0. 01~0. 2% (质量）添加物的由溶剂A和溶剂B混合而成的混合溶 剂，其中所述溶剂A选自二氯甲烧、正己烧中的至少一种，溶剂B选自甲醇、己醇中的至少一 种，所述添加物选自BHT(2，6-二叔了基-4-甲基苯酪）、BHA(了基哲基茵香離）、TB册（特 了基对苯二酪）中的至少一种。 优选的，所述混合溶剂中溶剂A和溶剂B的体积比为1:1~9:1。 本专利技术提供的技术方案具有如下有益效果： 本专利技术实现了小球藻胞内邮青素的快速无损检测，极大地简化了检测步骤，在建 立标准曲线后，检测样品时无需对样品进行提取操作，样品前处理简单，缩短了检测时间， 同时非常适宜用于微藻细胞尤其是小球藻细胞内邮青素的快速无损检测分析； 流式细胞术（Flow切tometry)可在488皿下激发小球藻胞内的邮青素发射巧光， 并分别检测小球藻细胞在533nm(FLl通道）和585nm(FL2通道）发射波长下的平均巧光强 度。本申请专利技术人意外的发现该两个特定发射波长下的平均巧光强度与小球藻胞内邮青素 含量之间存在高度正相关性。通过测定该平均巧光强度，并与HPLC测定结果相匹配，可W 准确、快速、无损地反映邮青素积累情况。该方法与常规方法相比，可W大大提高检测灵本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速无损检测小球藻胞内虾青素的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)建立标准曲线‑‑‑取多个虾青素含量已知的小球藻悬浮液已知样品，用去离子水或磷酸盐缓冲液重悬从所述小球藻悬浮液已知样品中收集到的藻细胞，调整为细胞密度在6×105～2×106CFU/mL之间的藻细胞重悬液，用配备有488nm氩离子激光器的流式细胞仪检测重悬液中藻细胞在FL1通道或FL2通道的平均荧光强度值；将小球藻悬浮液已知样品的虾青素含量的对数值和相应测得的FL1或FL2通道的平均荧光强度值的对数值作线性回归，得标准曲线；2)制备待测样品‑‑‑用去离子水或磷酸盐缓冲液重悬从待测小球藻悬浮液中收集到的藻细胞，调整为细胞密度在6×105～2×106CFU/mL之间的待测藻细胞重悬液，作为待测样品；3)用配备有488nm氩离子激光器的流式细胞仪检测待测样品在FL1通道或FL2通道的平均荧光强度值，根据步骤1)建立的标准曲线，算得待测样品的虾青素含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：魏东，陈俊辉，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44