一种耐高温木聚糖酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术的目的是提供一种耐高温木聚糖酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3、5、7。本发明专利技术提供的野生型木聚糖酶XynPF在65℃条件下处理5min后仅残留28％左右的酶活，在75℃、80℃条件下处理5min后酶活残留率几乎为0；而含S103Y单点突变的木聚糖酶突变体XynT1在65℃条件下处理5min后能保持50％以上的酶活，在75℃、80℃条件下处理5min后仍能分别保持35％、30％的酶活；而含S103Y/T175C/S184C三点突变的木聚糖酶突变体XynT3.1和含S103Y/N34C/T187C三点突变的木聚糖酶突变体XynT3.2在65℃条件下处理5min后均能保持90％以上的酶活，且在75℃、80℃条件下处理5min后仍能分别保持45％、35％左右的酶活。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于酶基因改造
，具体涉及一种耐高温木聚糖酶突变体及其应 用。
技术介绍
木聚糖（xylan)广泛存在于自然界中，是半纤维素的重要组分，它是自然界中含 量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一。在被 子植物中木聚糖占干物质重的15% -30%，在裸子植物中占干物质重的7% -12%。但木 聚糖具有很强的抗营养作用，在动物的消化道内不能被消化和吸收，而且会影响其它养分 的吸收利用，因而大大限制了富含木聚糖饲料（大麦、小麦、黑麦等）的应用。木聚糖酶 (Xylanase)是指能专一降解半纤维素木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称。人们对木 聚糖酶的研宄早在六十年代就已开始，主要研宄集中在食品、饲料、造纸、能源工业等方面 的木聚糖酶，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚糖酶。并 分离出多种木聚糖酶基因，已工业化生产多种木聚糖酶产品。 因为目前在颗粒生产过程中有一个短暂的80-90°C的高温阶段。青霉菌来源木聚 糖酶热稳定性较差，其水溶液在65°C下保温5分钟剩余酶活性低于30%，使该酶在颗粒饲 料的应用受到限制。采用饲料制粒后木聚糖酶液体喷涂到饲料上的方法不仅增加设备投 入，而且对酶制剂的稳定性、饲料中分布均一性都无法很好的保证。因此，提高木聚糖酶热 稳定性对目前饲料用木聚糖酶具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种耐高温木聚糖酶突变体及其在饲料中的应用。本专利技术通 过对来源于绳状青霉（Penicillium funiculosum)的木聚糖酶进行蛋白质工程改造，获得 了突变体蛋白，其耐热性得到显著提高，有利于其在饲料领域的广泛应用。 申请人通过对来源于绳状青霉的木聚糖酶进行大量突变的筛选，发现N34C、 S103Y、T175C、S184C和T187C这五个突变位点能引起木聚糖酶耐热性的提高，从而促成本 专利技术。 本专利技术一方面提供了一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO :1的木聚 糖酶的第103位氨基酸由Ser变为Tyr。 上述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO :3,其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO :4〇 本专利技术还包括携带有编码序列为SEQ ID NO :4的木聚糖酶突变体的质粒。 本专利技术一方面提供了另一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO :3的木 聚糖酶的第175位氨基酸由Thr变为Cys，第184位氨基酸由Ser变为Cys。 上述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO :5,其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO :6〇 本专利技术还提供携带编码序列为SEQ ID NO :6的突变体基因的质粒。 本专利技术还提供了一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO :3的木聚糖酶 的第34位氨基酸由Asn变为Cys，第187位氨基酸由Thr变为Cys。 所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO :7,其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO :8〇 本专利技术还包括携带有编码序列为SEQ ID NO :8的突变体基因的质粒。 本专利技术还提供了一种宿主细胞，包含携带有木聚糖酶突变体基因的质粒。 所述宿主细胞优选为毕赤酵母（Pichia pastoris)。 本专利技术提供的野生型木聚糖酶XynPF在65°C条件下处理5min后仅残留28%左右 的酶活，在75°C、80°C条件下处理5min后酶活残留率几乎为0 ;而含S103Y单点突变的木聚 糖酶突变体XynTl在65°C条件下处理5min后能保持50%以上的酶活，在75°C、80°C条件下 处理5min后仍能分别保持35%、30%的酶活；而含S103Y/T175C/S184C三点突变的木聚糖 酶突变体XynT3. 1和含S103Y/N34C/T187C三点突变的木聚糖酶突变体XynT3. 2在65°C条 件下处理5min后均能保持90%以上的酶活，且在75°C、80°C条件下处理5min后仍能分别 保持45%、35%左右的酶活。此外，与野生型相比，本专利技术筛选到的木聚糖酶突变体XynTl， XynT3. 1和XynT3. 2的最适作用pH值未发生变化，仍为5. 5,但其耐热性均得到显著提高， 因此更适合在饲料中的广泛应用。【具体实施方式】： 本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook,2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献 提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载 的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体 实施例的限定。 实验材料和试剂： 菌株与载体：大肠杆菌DH5a、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、Amp、G418购自 Invitrogen 公司。 酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas 公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂 盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。 培养基配方： 大肠杆菌培养基（LB培养基）：0. 5%酵母提取物，1%蛋白胨，1% NaCL，pH7. 0); LB-AMP培养基：LB培养基加100 μ g/mL氨苄青霉素； 酵母培养基（YH)培养基）：1%酵母提取物、2%蛋白胨2%葡萄糖； 酵母筛选培养基（MD培养基）：2%蛋白胨、2%琼脂糖； BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，IOOmM磷酸钾缓冲液（pH6.0)，l.34% YNB，4X10-5生物素，1 %甘油； BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，IOOmM磷酸钾缓冲液（pH6.0)，l.34% YNB，4X10-5 生物素，0. 5% 甲醇。 下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。 实施例1木聚糖酶基因的扩增 为了从绳状青霉中扩增得到木聚糖酶基因，设计PCR引物XynPF-Fl、XynPF-Rl如 下： XynPF-FI ：GCTGTTACATCCAACGAGACCGG XynPF-Rl ：TTAAGAGACGGTAATAGTAGAAG 以该绳状青霉基因组为模板，以上述引物进行PCR扩增，胶回收PCR产物，连接 pEASY-T载体，转化至大肠杆菌DH5a中，挑取正确的转化子进行测序。将测序正确的转化子 编码的木聚糖酶命名为XynPF，其氨基酸序列为SEQ ID NO :1，核苷酸序列为SEQ ID NO :2。 实施例2木聚糖酶突变体基因的扩增及合成 为了提高木聚糖酶XynPF的耐热性，通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的 筛选，设计PCR引物XynPF-F2、XynPF-R2如下： XynPF-F2 ：GGCGAATTCGCTGTTACATCCAACGAGACCGG (下划线为限制性内切酶 EcoRI 识别位点）； XynPF-R2 ：ATAGCGGCCGCTTAAGAGACGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴秀秀，王坤，邵弨，王华明，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37