本发明专利技术利用液滴微流控技术，设计构建了一种基于液滴的快速微生物直接绝对定量检测系统和方法。本发明专利技术的系统包括：微流控芯片、若干个细胞收集培养观测室、光学检测单元和图像处理单元。本发明专利技术方法包括：将样品前处理，注入到微流控芯片中，形成单分散单细胞液滴，对收集在细胞收集培养观测室中形成的单分散单细胞液滴进行细胞控温培养1-2小时；通过单个液滴的浊度判别是否存在活细胞及细胞生长速度的快慢，采集细胞收集培养观测室中的液滴放大图片，并对具有浊度的液滴进行计数，进而获取样品中微生物的数目。本发明专利技术所构建的基于液滴的快速微生物检测系统和方法系统简单，成本低，可同时适用于便携式现场检测和实验室检测，能应用于食品，环境、药品、保洁产品、化妆品等领域的微生物指标的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术构建了一种基于液滴单细胞包裹技术的快速微生物直接绝对定量检测系统和方法，为食品、药品、化妆品、保洁产品等中微生物的快速检测提供一种快速检测系统和方法，本专利技术属于生物技术和快速检测领域。
技术介绍
微生物污染存在在食品、化妆品、宝洁产品等的生产、加工、储存、运输、销售、到使用的整个过程的每个环节中，对人体产生严重的危害，检测产品是否存在微生物污染成了必不可少的关键环节。基于培养的微生物检测方法具有准确率高等特点，往往作为食品、药品和化妆品等微生物检测的金标和确证方法。但传统基于平板的培养检测方法培养周期长、效率低，监测过程繁琐不宜应用于即时现场或过程检测。其他包括免疫、核酸扩增、ATP发光等微生物检测方法分析周期短，适合快速检测，但这些方法都是相对定量方法，其假阳性或假阴性检出率高，准确性受到限制，往往仍然需要用培养方法来确证检测结果。发展一种快速基于培养的微生物检测方法能解决上述问题。液滴微流控技术为单细胞液滴包裹培养提供了强有力的技术支撑，同时其灵活、高通量的液滴操纵和检测技术也为基于单细胞培养的微生物快速检测提供了可能。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述不足之处，本专利技术要解决的技术问题是提供。本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案是:一种基于液滴的微生物快速直接绝对定量检测系统，包括:微流控芯片，内部包括微通道网络，用于通过动力驱动使液滴细胞/颗粒在所述微通道网络中流动，通过含表面活性剂的油相剪切作用使分散相细胞液被挤压形成单分散单细胞液滴；若干个细胞收集培养观测室，与所述微流控芯片中的若干支微通道——对应连通，用于收集单分散单细胞液滴；光学检测单元，以单个细胞培养观测室作为监测点，对所述监测点进行光学图像米集；图像处理单元，用于通过浊度对所述光学检测单元采集到的光学图像中的活细胞个数进行辨识。所述微通道网络包括含培养液的样品悬液进样口及其连接的微通道、含表面活性剂的油相进样口及其连接的微通道、液滴产生通道和液滴废液口及其连接的微通道；所述含培养液的样品悬液进样口连接的微通道、含表面活性剂的油相进样口连接的微通道连通于液滴产生通道的一端，所述液滴产生通道的另一端与所述细胞收集培养观测室连通，所述收集培养观测室还与液滴废液口连接的微通道连通。所述微流控芯片由PDMS、玻璃或塑料制成。所述微流控芯片由上下两层PDMS基片键合而成。所述微通道网络宽25?lOOum，深30?70um。所述光学检测单元为带光学放大功能的光学检测元件。一种基于液滴的微生物快速直接绝对定量检测方法，包括以下步骤:I)将样品前处理，并用微生物培养液或者包括细胞特征代谢物的指示剂，形成悬浮成液分散相，油相和表面活性剂混合形成连续相；2)将上述分散相液体经含培养液的样品悬液进样口、上述连续相液体经含表面活性剂的油相注入口驱动流入微流控芯片的微通道中，连续生成样品微液滴，部分液滴中包裹不超过一个微生物细胞；3)通过微流控芯片流体聚焦结构剪切形成单分散单细胞液滴；4)对收集在细胞收集培养观测室中形成的单分散单细胞液滴进行细胞控温培养1-2小时；5)通过单个液滴的浊度判别是是否存在活细胞及细胞生长速度的快慢，采集细胞收集培养观测室中的液滴放大图片，并对具有浊度的液滴进行计数，进而获取样品中微生物的数目。所述步骤5)可用下述步骤替换:6)通过液滴的颜色变化判别是是否存在活细胞，采集检测区液滴放大图片，经图像处理并计数具有特征颜色的液滴，进而获取样品中微生物的数目。所述步骤5)用下述步骤替换:7)通过液滴的荧光强度判别是是否存在活细胞，采集检测区液滴荧光图片，对荧光液滴计数，进而获取样品中微生物的数目。所述步骤2)根据不同的分析需求使用微量注射泵驱动、真空负压驱动或微量注射器负压抽吸驱动液滴的发生。本专利技术具有以下优点及有益效果:1.本专利技术所构建的基于液滴的微生物检测培养方法有效地结合了基于培养检测方法的高准确性和其他快速检测方法的高效率特点，为微生物高效、高准确率的检测提供了系统和方法。2.本专利技术所构建的系统和方法同时适用于便携式即时现场和实验室微生物检测。3.本专利技术所构建的系统和方法适用于包括食品、药品、化妆保洁等产品的在线质量控制和产品安全检测。4.本专利技术由多个液滴发生和检测单元集成，满足高通量、大体积样本液滴发生和光学成像检测可以通过浊度来辨识定量有无活细胞，以及个数是多少。5.能耗低，能采用电池供电；能在培养过程中避免液滴挥发提供湿度。【附图说明】图1为液滴微生物检测微流控芯片示意图:其中，1、含培养液的样品悬液进样口 ；2、含表面活性剂的油相进样口 ；3、液滴产生通道；4、细胞收集培育观测室；5、液滴废液口。图2为液滴微生物检测系统示意图:其中，6、监测点；7、光学检测单元；8、图像处理单元；9、微流控芯片。【具体实施方式】下面结合附图及实施例对本专利技术做进一步的详细说明。本专利技术的基本原理和过程如下:待分析样品经微生物富集预处理后形成悬液，采用液滴微流控技术形成单分散微生物细胞包裹液滴并收集到培养检测池中，控温培养，之后依据单细胞生长引起的光学变化(浊度、吸光度或荧光等)的液滴数目来对样品中微生物数目进行绝对定量。该专利技术能大幅度缩短传统基于平板培养检测微生物方法的培养周期，同时克服目前基于ATP发光、免疫、PCR等快速检测方法相对定量、假阳性或假阴性率高等问题。实施例1:基于液滴技术的便携式微生物检测如图1所示，本实例所构建的基于液滴技术的便携式微生物检测系统和方法，该微流控芯片9包括含培养液的样品悬液进样口 1、含表面活性剂的油相注入口 2,液滴产生通道3，液滴废液口 5。芯片由上下两层PDMS组成，上层包括宽25?lOOum，深30?70um的微通道网络，下层为PDMS基片。上下基片清洗后使用等离子体进行键合。将芯片抽负压使其形成真空，或使用微量注射器负压抽吸等方法产生驱动力。样品进行微生物富集预处理等后形当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于液滴的微生物快速直接绝对定量检测系统，其特征在于，包括：微流控芯片（9），内部包括微通道网络，用于通过动力驱动使液滴细胞/颗粒在所述微通道网络中流动，通过含表面活性剂的油相剪切作用使分散相细胞液被挤压形成单分散单细胞液滴；若干个细胞收集培养观测室（4），与所述微流控芯片（9）中的若干支微通道一一对应连通，用于收集单分散单细胞液滴；光学检测单元（7），以单个细胞培养观测室（4）作为监测点，对所述监测点进行光学图像采集；图像处理单元（8），用于通过浊度对所述光学检测单元（7）采集到的光学图像中的活细胞个数进行辨识。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马波，张旭，徐健，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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