樱花品种“红丰”和“市原虎尾”的分子特异性标记引物制造技术

本发明专利技术涉及一对特异性高的樱花品种“红丰”和“市原虎尾”的分子特异性标记引物，以及一种能对樱花品种“红丰”和“市原虎尾”进行快速鉴定的方法。所述引物序列如下：上游引物：5′‑AGCGGCCGCTACTAAATAGACAGC‑3′，下游引物：5′‑AGCGGCCGCTAGAAGAAGAACAAA‑3′。本发明专利技术分子特异性标记引物可对樱花品种“红丰”和“市原虎尾”进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别樱花品种所不能替代的分子手段。

【技术实现步骤摘要】
樱花品种“红丰”和“市原虎尾”的分子特异性标记引物(一)
本专利技术涉及樱花品种“红丰”和“市原虎尾”的分子特异性标记引物，以及利用该引物对樱花品种“红丰”和“市原虎尾”进行快速鉴定的方法。(二)
技术介绍
樱花隶属于蔷薇科(Rosaceae)樱属(Cerasus)，是世界著名的观赏植物。目前已知樱花品种有300多个，因其株型优美、花色艳丽、整个花期延续期长，在园林上有极大的应用价值。近年来，我国各地大规模种植樱花并应用于公园、学校、街道、庭院等绿地中，成为早春主要观赏花木之一。北京、武汉、青岛、上海等城市每年纷纷举办樱花节，樱花产业得到迅猛发展，这对于建设美丽中国，促进农民增收，推进山区综合开发和建设社会主义新农村，都具有十分重要的意义。我国樱属植物资源丰富，分布广泛，且樱属植物表型具有较强可塑性，种间杂交容易，品种数量众多，有些品种间性状差异较小，传统形态分类很难快速、准确有效评价与区分。学术界对目前种植樱花品种的名称和描述都很混乱，“同物异名”或“同名异物”现象较为严重，缺乏统一规范的名称及科学系统的分类体系，不便于品种鉴定、推广、交流及新品种的培育，因此亟需建立一个科学合理的樱花品种分类鉴定系统。目前就全国范围内的樱花品种调查和分类还仅仅是通过传统的形态学特征、过氧化物酶和酯酶同工酶技术、电镜扫描花粉粒和Q型聚类分析等方法，这些方法尽管有用，但很难对樱花品种进行正确的鉴定和应用。而近年来在植物分类界已广泛应用的DNA分子标记技术迄今尚未在樱花品种分类、品种间亲缘关系及遗传多样性等研究上得以应用。因此，有必要利用分子标记技术手段，对我国现有的樱花品种进行科学鉴别，不仅有助于樱花品种分类鉴定系统的建立，也为樱属植物资源的进一步研究提供分子依据。目前国内引进大量的樱花品种，在北京、青岛、武汉、上海等各大公园内广泛栽植，观赏价值极高，其中以晚樱品种居多，普遍具有花量大、花色艳丽、花瓣多、花期长、抗性强、适应性广等特点。我们经过长期的调查工作，发现20个晚樱品种包括红笠(Cerasusserrulata‘Benigasa’)、红华(C.serrulata‘Kouka’)、一叶(C.serrulata‘Hisakura’)、福绿寿(C.serrulata‘Contorta’)、普贤象(C.serrulata‘Albo-rosea’)、松月(C.serrulata‘Superba’)、郁金(C.serrulata‘Grandifora’)、红丰(Cerasus×sieboldii‘Beni‐yutaka’)、御衣黄(C.serrulata‘Gioiko’)、关山(C.serrulata‘Kanzan’)、大提灯(C.serrulata‘Ojochin’)、八重红枝垂(C.spachiana‘PlenaRosea’)、市原虎尾(C.serrulata‘AlboPlena’)、咲耶姬(Cerasus×yedoensis‘Sakuyahime’)、朱雀(C.serrulata‘Shujaku’)、杨贵妃(C.serrulata‘Mollis’)、雨情枝垂(C.spachiana‘Ujou‐shidare’)、菊垂樱(C.serrulata‘Plena-pendula’)、平野妹背(C.serrulata‘Imose’)、旭山樱(C.serrulata‘Asahiyama’)在园林中的应用极其广泛，但这些品种的“同名异物”、“同物异名”现象也异常严重，从表型特征方面很难鉴别，给园林植物应用、推广以及新品种选育带来很多困难，因此着力从分子水平上开发出这些品种稳定、特异的DNA指纹标记才是实现樱花品种准确快速鉴定的科学途径。(三)
技术实现思路
本专利技术目的提供樱花品种“红丰”和“市原虎尾”的分子特异性标记引物，以及一种能对樱花品种“红丰”和“市原虎尾”进行快速鉴定的方法。本专利技术采用的技术方案是：樱花品种“红丰”和“市原虎尾”的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：上游引物：5′-AGCGGCCGCTACTAAATAGACAGC-3′；下游引物：5′-AGCGGCCGCTAGAAGAAGAACAAA-3′。该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验获得樱花品种“红丰”和“市原虎尾”的特异性DNA片段之后，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础设计特异性引物，以该特异性引物对樱花品种进行PCR扩增，仅“红丰”和“市原虎尾”可获得466bp大小的特异性片段，其他樱花品种均不能获得特异性片段。需要说明的是，本专利技术分子特异性标记引物仅限于樱花品种的鉴定(鉴定其是否为“红丰”或“市原虎尾”之一，后续再进行进一步鉴定)，即待测样品仅限于樱花。本专利技术还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物对樱花品种“红丰”和“市原虎尾”进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测樱花品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现466bp的特异DNA条带，则待测樱花品种为樱花品种“红丰”或“市原虎尾”，反之则否；所述分子特异性标记引物序列为：上游引物：5′-AGCGGCCGCTACTAAATAGACAGC-3′；下游引物：5′-AGCGGCCGCTAGAAGAAGAACAAA-3′。本专利技术方法关键在于扩增引物的选择、DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。优选的，本专利技术所述PCR反应体系组成如下：所述PCR扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃变性40s，65℃退火40s，72℃延伸2min，共35个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。PCRBuffer终浓度为1×，是指PCRBuffer中各组分在反应体系中的浓度与1×PCRBuffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10×PCRBuffer。10×PCRBuffer成分为：100mMTris-HCl(pH8.5)、500mMKCl、25mMMgCl2和1.0％Triton-X-100，溶剂为ddH2O。具体的，所述方法如下：(1)取待测樱花叶片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待测樱花叶片的基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：PCR扩增体系每25μL组成如下：PCR扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃变性40s，65℃退火40s，72℃延伸2min，共35个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；(3)取步骤(2)扩增产物5μL，与1μL0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现466bp的DNA条带，则待测樱花品种为“红丰”或“市原虎尾”，反之则否。本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术分子特异性标记引物可对樱花品种“红丰”和“市原虎尾”进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别樱花品种所不能替代的分子手段。(四)附图说明图1为对樱花品种进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准；编号8和13分别为樱花品种“红丰”和“市原虎尾本文档来自技高网...

【技术保护点】
樱花品种“红丰”和“市原虎尾”的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：上游引物：5′‑AGCGGCCGCTACTAAATAGACAGC‑3′，下游引物：5′‑AGCGGCCGCTAGAAGAAGAACAAA‑3′。

【技术特征摘要】
1.樱花品种“红丰”和“市原虎尾”的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：上游引物：5′-AGCGGCCGCTACTAAATAGACAGC-3′，下游引物：5′-AGCGGCCGCTAGAAGAAGAACAAA-3′。2.一种利用权利要求1所述的分子特异性标记引物对樱花品种“红丰”和“市原虎尾”进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测樱花品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现466bp的特异DNA条带，则待测樱花品种为樱花品种“红丰”或“市原虎尾”，反之则否；所述分子特异性标记引物序列为：上游引物：5′-AGCGGCCGCTACTAAATAGACAGC-3′，下游引物：5′-AGCGGCCGCTAGAAGAAGAACAAA-3′。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下：95℃预变性3min；95...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐梁，李海波，杨少宗，魏海龙，赵庆杰，柳新红，
申请(专利权)人：浙江省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33