一种橡胶树体细胞胚胎发生和植株再生的方法技术

本发明专利技术属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种橡胶树体细胞胚胎发生和植株再生的方法。本发明专利技术的特征包括外植体的选取和剥离、愈伤组织诱导、胚状体诱导和植株诱导再生。方法是：选取橡胶树叶片古铜期或淡绿期的芽条或芽条摘顶后侧芽萌发3-4周的幼嫩侧枝，切成1-1.5cm带有腋芽的茎段，经适当灭菌，将消毒的茎段于无菌条件剥离出的腋芽点为外植体，经愈伤和体胚诱导获得再生植株。本发明专利技术克服了传统花药培养和内珠被培养中外植体取材时间短和基因型的制约的缺陷，本发明专利技术建立的橡胶树再生体系为橡胶树组培苗工厂化生产以及遗传转化体系提供了新的途径。

【技术实现步骤摘要】
一种橡胶树体细胞胚胎发生和植株再生的方法
本专利技术涉及植物细胞工程
，具体涉及一种橡胶树体细胞胚胎发生和植株再生的方法。本专利技术以橡胶树古铜期或淡绿期的芽条或芽条被摘顶后由其侧芽萌发3-4周的幼嫩侧枝的带腋芽的茎段为外植体，通过体细胞发生途径获得橡胶树再生植株。
技术介绍
橡胶树(HeveabrasiliensisMuell-Arg)属大戟科橡胶属，是多年生的异花授粉乔木，在热带地区广泛种植。其所产的天然橡胶是重要的工业原料和战略物资，在国民经济中占有举足轻重的地位。通过体细胞发生途径来获得再生植株是植物组培苗工厂化生产和遗传转化的重要方法。现有技术中，橡胶树体细胞发生途径获得再生植株主要采用花药培养和内珠被培养。橡胶树花药培养技术是以处于单核期的橡胶树雄花为外植体，剥离雄蕊，接种于诱导愈伤培养基中诱导愈伤组织，再将愈伤组织接种于诱导体胚培养基诱导体胚发生，最后将成熟胚状体接种于植株再生培养基中诱导出完整小植株。橡胶树内珠被培养技术是以橡胶树授粉后45-75天的幼果中的内珠被为外植体，诱导愈伤组织，再经愈伤组织分化体胚，最后由成熟的胚状体分化成植株。上述两种再生技术体系均存在如下缺点：①易受取材季节制约，不能长期进行培养。橡胶树每年开花三次，分为春花、夏花和秋花，每次花期较短，一般为半个月，能进行花药培养的时间较短。众所周知，橡胶树的春花的自然授粉较高，而夏花、秋花的自然授粉较低，因此内珠被的取材时间一般为春花自然授粉后45-75d，也就是在中国海南每年的5月中旬至6月中旬为采样进行内珠被培养的最佳时期，这种较短的取材时间严重制约了内珠被的培养。②橡胶树的植株再生极度依赖于基因型。在花药培养中，仅限于海垦2、热研88-13等少数几个品种成功建立花药培养体系。在内珠被培养中，也仅限于PB260等少数几个品种成功建立内珠被培养体系。而对于大量的其它品种由于体胚发生能力差而不能成功建立体细胞发生体系(孙爱花等，橡胶树花药的培养，植物生理学通讯，2006，42(4)：785-789；黄天带等，橡胶树内珠被研究进展，生命科学研究，2011，15(2)：176-183)。这些缺点制约了橡胶树组培苗工厂化生产和遗传转化体系的建立，因此必须在橡胶树中建立一种高效、不受采样时间限制和非基因依赖性的体细胞胚胎发生技术体系，为组培苗工厂化生产和遗传转化体系的建立提供新技术途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种橡胶树体细胞胚胎发生和植株再生的方法。本专利技术利用橡胶树的芽条及其侧芽生长不受季节影响的优势，以幼嫩芽条和芽条的幼嫩侧枝中的腋芽为外植体，通过愈伤组织诱导、体胚发生和植株再生途径，本专利技术的方法不受采样时间限制和非基因依赖性，是一种高效的橡胶树体细胞发生培养体系。本专利技术通过下属技术方案实现：一种橡胶树体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其最佳实施方案包括下列步骤：(1)外植体的选取、消毒和剥离：选取橡胶树古铜期或淡绿期的芽条或芽条被摘顶后由其侧芽萌发3-4周龄的幼嫩侧枝，用剪刀剪除叶片，将枝条切成1-1.5cm带有腋芽的茎段。将带有腋芽的茎段用洗洁精清洗5分钟，再用自来水冲洗30分钟，滤纸吸干，然后用70％的酒精消毒30-60秒，0.15％升汞溶液消毒8-12分钟，用无菌水冲洗5遍，用无菌滤纸吸干。将消毒好的茎段于无菌条件下置于超净工作台的体视显微镜中，小心剥离出橡胶树腋芽点外植体。(2)愈伤组织诱导：将剥离出的橡胶树腋芽点接种于愈伤组织诱导培养基中，于24-28℃暗培养50-70天。愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，附加2,4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)10mg/L，NAA(萘乙酸)2mg/L，6-BA(6-苄基氨基嘌呤)0.5mg/L，蔗糖40g/L，椰子水5％(V/V)，Phytagel2.2g/L；补充蒸馏水至1L。灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。(3)体胚(胚状体)诱导：将愈伤组织接种于胚状体诱导培养基中于24-28℃暗培养50-70天。胚状体诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，将MS培养基中大量元素的浓度降为80％，微量元素浓度增加1倍，附加6-BA0.5mg/L，KT(细胞激动素)2mg/L，NAA1mg/L，GA3赤霉素)0.5mg/L，活性碳0.1％(W/V)，蔗糖40g/L，Phytagel2.2g/L；补充蒸馏水至1L。灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。(4)植株诱导：将成熟的胚状体接种于植株诱导培养基中，于24-28℃，光照强度为2000Lux条件下培养40-50天。植株诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，将MS培养基中大量元素的浓度降为80％，附加KT1mg/L，GA31mg/L，活性碳0.1％(W/V)，蔗糖30g/L，Phytagel2.2g/L；补充蒸馏水至1L。灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2。申请人公开了一种适用于橡胶树芽条或芽条摘顶后萌发的带腋芽茎段的体细胞胚胎发生和植株再生的培养基，按下述成分和配制方法配制：(1)愈伤组织诱导培养基：以MS培养基为基础培养基，附加2,4-D10mg/L，萘乙酸2mg/L，6-苄基氨基嘌呤0.5mg/L，蔗糖40g/L，椰子水5％(V/V)，Phytagel2.2g/L；pH5.8-6.2；(2)胚状体诱导培养基：以MS培养基为基础培养基，将MS培养基中大量元素的浓度降为80％，微量元素浓度增加1倍，附加6-苄基氨基嘌呤0.5mg/L，细胞激动素2mg/L，萘乙酸1mg/L,赤霉素0.5mg/L，活性碳0.1％(W/V)，蔗糖40g/L，Phytagel2.2g/L；pH5.8-6.2；(3)植株诱导培养基：以MS培养基为基础培养基，将MS培养基中大量元素的浓度降为80％，附加细胞激动素1mg/L，赤霉素1mg/L，活性碳0.1％(W/V)，蔗糖30g/L，Phytagel2.2g/L；pH5.8-6.2。本专利技术建立的一种橡胶树体细胞胚胎发生和植株再生的方法及其培养基可以在橡胶树离体繁殖中应用。本专利技术的有益效果：1.本专利技术所采用的外植体来源不受采样季节限制，可以长年进行橡胶树组织和细胞培养的橡胶树的芽条及其侧芽，克服了现有技术的外植体取材时间上的制约。2.与现有技术相比，本专利技术克服了橡胶树的基因型的制约，建立了橡胶树非基因型依赖的体细胞高效再生培养体系。3.本专利技术为橡胶树芽条或芽条摘顶后萌发的带腋芽茎段的组织培养快速成苗提供了高效工厂化育苗技术，对我国橡胶树战略发展具有重要意义。具体实施方式下面用实施例来进一步详述本专利技术，应当指出，对于本
技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本专利技术的保护范围。实施例1：本实施例公开的方法是本专利技术的最佳实施例，但是实施本专利技术并不限于此。本实施例的具体步骤如下所述：(1)外植体的选取、消毒和剥离：选取橡胶树常用品种海垦2、热研7-33-97、热研8-79、RRIM600、PR107等五个品种(但不限于上述举例的橡胶树品种；上述海垦2、热研7-33-97、热研8-79、RRIM600、PR107等五个橡胶树品种来源参见：黄华孙主编，中国橡胶树育种五十年，北京：中国农业出版社，2005：174－192，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种橡胶树体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于按照以下步骤：(1)外植体选取、消毒和剥离：选取橡胶树叶片古铜期或淡绿期的芽条或芽条摘顶后由其侧芽萌发3‑4周龄的幼嫩侧枝，切成1‑1.5cm带有腋芽的茎段，用洗洁精清洗5分钟，再用自来水冲洗30分钟，70％酒精消毒30‑60秒，0.15％升汞溶液消毒8‑12分钟，无菌水冲洗5遍，用无菌滤纸吸干，将消毒后的茎段于无菌条件下置于体视显微镜中，剥离得到腋芽点外植体；(2)愈伤组织诱导：将剥离得到的腋芽点外植体接种于愈伤组织诱导培养基中，于24‑28℃暗培养50‑70d；所述愈伤组织培养基是以MS培养基为基础培养基，附加2，4‑D 10mg/L，萘乙酸2mg/L，6‑苄基氨基嘌呤0.5mg/L，蔗糖40g/L，椰子水5％(V/V)，Phytagel 2.2g/L，补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8‑6.2；(3)体胚诱导：将愈伤组织接种于胚状体诱导培养中，于24‑28℃暗培养50‑70天；所述的胚状体诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，将MS培养基中大量元素的浓度降为80％，微量元素浓度增加1倍，附加6‑苄基氨基嘌呤0.5mg/L，细胞激动素2mg/L，萘乙酸1mg/L,赤霉素0.5mg/L，活性碳0.1％(W/V)，蔗糖40g/L，Phytagel 2.2g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8‑6.2；(4)植株诱导：将成熟的胚状体接种于植株诱导培养基中，于24‑28℃，光照强度为2000Lux的光照条件下培养40‑50天；所述的植株诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，将MS培养基中大量元素的浓度降为80％，附加细胞激动素1mg/L，赤霉素1mg/L，活性碳0.1％(W/V)，蔗糖30g/L，Phytagel 2.2g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8‑6.2。...

【技术特征摘要】
1.一种橡胶树体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于按照以下步骤进行：(1)外植体选取、消毒和剥离：选取橡胶树叶片古铜期或淡绿期的芽条或芽条摘顶后由其侧芽萌发3-4周龄的幼嫩侧枝，切成1-1.5cm带有腋芽的茎段，用洗洁精清洗5分钟，再用自来水冲洗30分钟，70％酒精消毒30-60秒，0.15％升汞溶液消毒8-12分钟，无菌水冲洗5遍，用无菌滤纸吸干，将消毒后的茎段于无菌条件下置于体视显微镜中，剥离得到腋芽点外植体；(2)愈伤组织诱导：将剥离得到的腋芽点外植体接种于愈伤组织诱导培养基中，于24-28℃暗培养50-70d；所述愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，附加2，4-D10mg/L，萘乙酸2mg/L，6-苄基氨基嘌呤0.5mg/L，蔗糖40g/L，椰子水5％(V/V)，Phytagel2.2g/L，补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2；(3)体胚诱导：将愈伤组织接种于胚状体诱导培养基中，于24-28℃暗培养50-70天；所述的胚状体诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，将MS培养基中大量元素的浓度降为80％，微量元素浓度增加1倍，附加6-苄基氨基嘌呤0.5mg/L，细胞激动素2mg/L，萘乙酸1mg/L,赤霉素0.5mg/L，活性碳0.1％(W/V)，蔗糖40g/L，Phytagel2.2g/L；补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8-6.2；(4)植株诱导：将成熟的胚状体接种于植株诱导培养基中，于24-28℃，光照强度为2000Lux的光照条件下培养40...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭德冠，张家明，安瓦·堪彭乔，韩冰莹，付莉莉，孙雪飘，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：海南;66