一种抗根肿病的甘蓝‑大白菜远缘杂种的创制方法技术

本发明专利技术公开了一种抗根肿病的甘蓝‑大白菜远缘杂种的创制方法。该方法是以抗根肿病大白菜为母本，甘蓝为父本，进行人工杂交育种，采用重复授粉以及离体培养手段进行幼胚拯救，对获得的再生植株进行秋水仙素人工加倍，然后结合形态学、细胞DNA相对含量以及根肿病抗性鉴定，获得抗根肿病种间杂交新种质。本发明专利技术方法对促进甘蓝品种改良具有重要的理论研究和实际应用价值。

Method for producing clubroot resistant cabbage Chinese cabbage hybrids

The invention discloses a method for producing clubroot resistant cabbage Chinese cabbage hybrids. This method is based on clubroot resistance of Chinese cabbage cabbage as female parent, as the male parent, artificial breeding, using repeated pollination and cultured in vitro by means of embryo rescue, the regenerated plants were then combined with artificial doubling colchicine, cell morphology, DNA content and clubroot resistance identification, obtained for clubroot resistance the hybridization between new germplasm. The method of the invention has important theoretical research and practical application value for promoting the improvement of cabbage varieties.

【技术实现步骤摘要】
一种抗根肿病的甘蓝-大白菜远缘杂种的创制方法
本专利技术属于生物技术育种领域，涉及一种抗根肿病的甘蓝-大白菜远缘杂种的创制方法。
技术介绍
根肿病是由根肿菌属芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron.)侵染引起的、危害十字花科作物的一种传染性非常强的土壤病害，结球甘蓝(BrassicaoleraceaL.Var.Capitata,，2n＝2x＝CC＝18，简称甘蓝)是受其危害严重的寄主之一；目前生产上非常缺乏抗根肿病甘蓝品种。甘蓝对根肿病抗性属于数量性状遗传，由多基因控制，易受环境影响；而且主要是隐性基因，这就使得利用常规育种方法改良甘蓝根肿病抗性存在困难并且进展缓慢。国内外对大白菜抗根肿病的研究表明，大白菜对根肿病菌的侵染大多表现受显性单基因控制。其中位于A3连锁群的CRb基因对根肿菌生理小种2、4和8表现抗性，是一个优良的抗性基因。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前甘蓝资源遗传基础狭窄，抗根肿病资源缺乏这一现状，提供一套利用胚胎拯救获得甘蓝-大白菜远缘杂种的方法，创造一批抗根肿病的甘蓝-大白菜远缘杂种；同时为扩大甘蓝基因库，引进近缘种中优异的目标性状(基因)，形成一套甘蓝品种改良的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种抗根肿病的甘蓝-大白菜远缘杂种的创制方法，包括以下步骤：(1)授粉方法：以抗根肿病大白菜为母本，甘蓝为父本，配置杂交组合,采用人工剥蕾去雄重复授粉的方法，取父本新鲜花粉，涂抹在母本去雄的花蕾柱头上；(2)胚珠培养：取授粉后10d的子房消毒灭菌，剥取子房中的胚珠接种到胚挽救培养基上,在环境25±0.5℃，光照强度50-100μmol·m–2·s–1，光照时长12-14h·d–1条件下培养25～30d，所述的胚挽救培养基为：MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+0.6g/L水解酪蛋白+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；(3)分化培养：待幼胚长至子叶形胚时，接入分化培养基诱导不定芽分化，所述的分化培养基为：MS+0.1mg/LNAA+1mg/L6-BA+6g/L琼脂+28g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；(4)继代培养：20～30d后转入继代培养，继代培养基为：MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；(5)生根培养：继代2周后接入生根培养基诱导生根，所述的生根培养基为：1/2MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LIBA+20g/L糖+7g/L琼脂，pH为5.90～5.95；(6)人工加倍：将修剪好的植株根部浸泡在配制的秋水仙素溶液中进行加倍，所述的处理条件为含2％二甲基亚砜浓度为0.4％的秋水仙素溶液中处理18-20h，处理完毕后，将根部的秋水仙素残液冲洗干净，最后定植于含有草炭土、珍珠岩和蛭石的穴盘中；(7)形态学鉴定：对幼苗营养生长阶段、生殖生长阶段的主要形态特征进行观察；(8)细胞DNA相对含量测定：用流式细胞仪对后代加倍植株进行细胞DNA相对含量测定；(9)根肿病抗性鉴定：通过菌土法接种鉴定和抗根肿病基因CRb的分子标记验证相结合鉴定根肿病抗性，将基质灭菌后，每克灭菌土中接种0.001g病根，然后直接将鉴定材料播于菌土中，于25-28℃下培养，2个月后拔出幼苗，洗净根部杂质，观察发病情况；同时，利用与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的SSR引物TCR13对后代植株进行分子标记鉴定，当后代材料的扩增谱带中出现抗根肿病大白菜所具有的特异条带时，即可判定其为携带CRb基因的真杂种。其中，步骤(1)中所述的杂交组合的配置为：抗根肿病大白菜为母本，甘蓝为父本。其中母本为引进的1份对根肿病表现免疫、携带CRb基因的大白菜材料。步骤(2)中子房消毒灭菌方法为：用75％(体积分数)的乙醇消毒1min，然后用7％(体积分数)的次氯酸钠灭菌15min，再用用无菌水冲洗3次，每次5min。步骤(6)中秋水仙素溶液进行加倍处理时一定要没过根部。步骤(6)中草炭土、珍珠岩和蛭石的体积比为8:1:1。步骤(9)中所述的与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的SSR引物TCR13上游引物序列为TGTTGATTGTGGATTTTTGTGA(SEQIDNO.1)，下游引物序列为CCAAACTAGCCAATAACCATTGTA(SEQIDNO.2)。步骤(9)中当后代材料的扩增谱带中出现抗根肿病大白菜所具有的313bp特异条带时，即可判定其为携带CRb基因的真杂种。有益效果本专利技术利用抗根肿病大白菜和甘蓝为材料，采用幼胚拯救技术进行甘蓝抗性改良，促进大白菜与甘蓝之间的遗传杂交，合并两个种的优异基因，获得了一批优异的种间新种质，为进一步渐渗转移利用抗根肿病基因、改良甘蓝品种奠定基础。本专利技术提供的一种大白菜与甘蓝远缘杂交新种质创制方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：(1)本专利技术利用的是携带CRb基因的大白菜抗源，经鉴定其对根肿病抗性达免疫水平，是一个非常理想的抗源材料。(2)本专利技术在胚挽救的MS培养基添加了0.1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+0.6g/L水解酪蛋白，提高了胚胎拯救率和诱导率。(3)本专利技术在人工加倍中使用的处理是含2％二甲基亚砜(DMSO)浓度为0.4％的秋水仙素溶液中处理18h，提高了种间杂种的加倍率。附图说明图1远缘杂种F1形态学鉴定。(a)甘蓝(左)、杂种F1(中)、大白菜(右)营养生长期表型；(b)甘蓝(左)、杂种F1(中)、大白菜(右)生殖生长期表型；(c)甘蓝(左)、杂种F1(中)、大白菜(右)种子表型；图2引物TCR13对远缘杂种F1鉴定的扩增结果1-4为母本大白菜，5-10和13-17携带CRb基因的真杂种，11-12为假杂种，18-19为父本甘蓝。箭头所示为与CRb基因连锁的抗病带型具体实施方案本专利技术所提供的一种抗根肿病的甘蓝-大白菜远缘杂种的创制方法，通过以下实施例对本专利技术作进一步的详细说明，但本专利技术的内容不局限于此：1.甘蓝-大白菜种间杂交后代材料的获得1.1材料选择甘蓝为不同基因型的二倍体高代纯合材料，大白菜为抗根肿病的二倍体材料。1.2幼胚拯救及杂种获得(1)授粉方法：于塑料大棚内进行杂交，甘蓝和大白菜互为父母本进行杂交，在母本开花前1～2d剥蕾去雄,授以父本的花粉,套袋隔离。次日开始采用重复授粉法进行人工授粉(每天授粉一次，重复三次)。结果表明，以大白菜为母本的幼胚拯救率高于以甘蓝为母本。(2)幼胚拯救：取授粉后7d、10d、12d的子房,用75％(体积分数)的乙醇消毒1min，然后用7％(体积分数)的次氯酸钠灭菌15min，再用用无菌水冲洗3次，每次5min。剥取子房中的胚珠接种到胚挽救培养基上在环境温度25±0.5℃，光照强度75μmol·m–2·s–1，光照时长14h的条件下培养28d。所述的胚挽救培养基处理为：0(CK，MS+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.95)、添加0.1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA、添加0.6g/L水解酪蛋白、添加0.1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+0.6g/L水解酪蛋白。结果表明,授粉后10d的子房，在MS培养基中添加0.1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗根肿病的甘蓝‑大白菜远缘杂种的创制方法,其特征在于包含以下步骤：(1)授粉方法：以抗根肿病大白菜为母本，甘蓝为父本，配置杂交组合,采用人工剥蕾去雄重复授粉的方法，取父本新鲜花粉，涂抹在母本去雄的花蕾柱头上；(2)胚珠培养：取授粉后10d的子房消毒灭菌，剥取子房中的胚珠接种到胚挽救培养基上,在环境25±0.5℃，光照强度50‑100μmol·m

【技术特征摘要】
1.一种抗根肿病的甘蓝-大白菜远缘杂种的创制方法,其特征在于包含以下步骤：(1)授粉方法：以抗根肿病大白菜为母本，甘蓝为父本，配置杂交组合,采用人工剥蕾去雄重复授粉的方法，取父本新鲜花粉，涂抹在母本去雄的花蕾柱头上；(2)胚珠培养：取授粉后10d的子房消毒灭菌，剥取子房中的胚珠接种到胚挽救培养基上,在环境25±0.5℃，光照强度50-100μmol·m–2·s–1，光照时长12-14h·d–1条件下培养25～30d，所述的胚挽救培养基为：MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+0.6g/L水解酪蛋白+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；(3)分化培养：待幼胚长至子叶形胚时，接入分化培养基诱导不定芽分化，所述的分化培养基为：MS+0.1mg/LNAA+1mg/L6-BA+6g/L琼脂+28g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；(4)继代培养：20～30d后转入继代培养，继代培养基为：MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；(5)生根培养：继代2周后接入生根培养基诱导生根，所述的生根培养基为：1/2MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LIBA+20g/L糖+7g/L琼脂，pH为5.90～5.95；(6)人工加倍：将修剪好的植株根部浸泡在配制的秋水仙素溶液中进行加倍，所述的处理条件为含2％二甲基亚砜浓度为0.4％的秋水仙素溶液中处理18-20h，处理完毕后，将根部的秋水仙素残液冲洗干净，最后定植于含有草炭土、珍珠岩和蛭石的穴盘中；(7)形态学鉴定：对幼苗营养生长阶段、生殖生长阶段的主要形态特征进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾爱松，严继勇，陈龙正，宋立晓，闫圆圆，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32